细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶体系与IMS联用进行水产品致病菌的快速检测

摘要

致病菌污染可导致多种食源性疾病的发生，严重危害人类健康，是影响食品安全的首要因素。研究和发展新型、快速、灵敏、特异的致病菌检测技术，己成为保证食品安全的关键。本论文基于生物发光的原理，借助于免疫磁珠分选(IMS)技术平台，建立了适用于水产品致病菌检测的细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶体系。该双酶体系通过检测细菌胞内NADH达到检测致病菌数量的目的。应用该体系对水产品中单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌进行了快速识别检测。 第一、本论文对细菌荧光素酶-NADH: FMN氧化还原酶体系进行了优化，建立了适合测定NADH含量的双酶体系。应用该体系检测NADH具有高灵敏性，NADH的检测限为1×10-10 mol/L，远高于传统方法——紫外法和荧光法NADH检测限(1x10-5mol/L，1×10-8mol/L)。 第二、选用免疫磁珠分选作为样品的前处理方法，可以解决细菌荧光素酶-NADH:FMN氧化还原酶体外发光体系无法对不同菌种胞内NADH进行特异识别的问题，从而达到特异检测目的菌的目的。本论文评价了商品化Dynabeads anti-Listeria和Dynabeads anti-Salmonella对致病菌免疫分选效果，确定了免疫磁珠分选法的检测限——单增李斯特菌的检测限为4×102cfu/mL、鼠伤寒沙门氏菌的检测限为5cfu/mL；分析了免疫磁珠的特异性，研究了竞争菌对免疫磁珠分选目的菌的影响；对被高浓度致病菌污染(目的菌)的样品进行免疫磁珠分选；通过改变磁珠工作体积(由20μL优化为60μL)提高了目的菌与免疫磁珠的结合率，以满足双酶体系检测致病菌菌数的灵敏性要求。 自行制备了霍乱弧菌免疫磁珠，并进行了性能分析。为利用细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶体系检测水产品中更多种类致病菌打下基础。 第三、对细菌胞内NADH的提取作了探讨，确定热Tris-HCl法作为菌体胞内NADH的提取方法。利用双酶体系对单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌进行测定，确定两种菌单位菌体胞内NADH含量分别为2.38×10-17mol/cell，2.78×10-16mol/cell，为今后的定量生物发光传感器打好基础。 第四、细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶体系与IMS联用对纯培养和水产品样品中的单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌进行检测。两种致病菌的菌数在108～1010cfu/mL(g)间与双酶体系的发光强度呈一定的线性关系。在不增菌的情况下，整个检测过程在1h内完成，检测限为108cfu/ml(g)。体系的灵敏性有待进—步的提高。 第五、对单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌的前增菌做了初步研究，以提高双酶体系灵敏性。选择EB增菌液及亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)分别对单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌进行增菌，得到以下结论：EB增菌液对非单增李斯特菌有强烈的抑制作用，单增李斯特菌污染量为1 cfu/g的样品经过32h培养可满足双酶体系的灵敏性；鼠伤寒沙门氏菌污染量为1 cfu/g的样品经过12 h培养也可满足双酶体系的灵敏性。在增菌的情况下，34h、14h内可完成单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌的检测，检测限均为1cfu/g样品。 总之，本论文建立的细菌荧光素酶-NADH: FMN氧化还原酶双酶与IMS联用检测体系是—种特异，灵敏，简便，高效，易操作的快速检测方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

0前言

0.1我国水产品行业现状

0.2水产品致病菌污染情况及检测方法

0.2.1水产品中主要致病菌

0.2.2国内外水产品中致病菌检测方法的研究现状

0.3免疫磁珠技术

0.3.1免疫磁珠的性质

0.3.2免疫磁珠技术的基本原理

0.3.3免疫磁珠技术的应用

0.4细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶的生物发光体系

0.4.1细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶的性质和结构

0.4.2细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶反应原理

0.4.3细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶生物发光体系的应用

0.5本论文的研究目的和意义

参考文献

1细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶体系的建立

1.1引言

1.2实验仪器与材料

1.2.1主要仪器

1.2.2主要试剂

1.2.3菌种

1.2.4培养基

1.2.5主要试剂配置

1.3实验方法

1.3.1双酶提取

1.3.2生物发光强度测定

1.3.3双酶酶活测定

1.3.4生物发光反应的动力学曲线

1.3.5NADH标准曲线的测定

1.4结果与讨论

1.4.1生物发光反应的动力学曲线

1.4.2细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶体系优化

1.4.3双酶提取过程中粗酶发光强度的监测

1.4.4 NADH标准曲线的测定

1.5小结

参考文献

2免疫磁珠法分选水产品中致病菌的研究

2.1引言

2.2实验仪器与材料

2.2.1实验仪器

2.2.2主要试剂与材料

2.3.3菌种

2.3.4培养基

2.3实验方法

2.3.1免疫磁珠分选法的分选步骤

2.3.2免疫磁珠分选菌前后的形态观察

2.3.3纯菌培养及菌悬液制备

2.3.4 Dynabeads anti-Listeria的灵敏性实验

2.3.5Dynabeads anti-Salmonella灵敏性实验

2.3.6 Dynabeads anti-Listeria的特异性实验

2.3.7 Dynabeads anti-Salmonella特异性实验

2.3.8高菌液浓度的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌的免疫磁珠分选

2.3.9免疫磁珠分选水产品中单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌

2.3.10霍乱弧菌免疫磁珠的制备

2.3.11霍乱弧菌免疫磁珠分选菌体的条件优化

2.3.12免疫磁珠分选霍乱弧菌的应用

2.4结果与讨论

2.4.1免疫磁珠分选菌前后的形态观察结果

2.4.2 Dynabeads anti-Listeria的灵敏性实验结果

2.4.3 Dynabeads anti-Salmonella灵敏性结果

2.4.4 Dynabeads anti-Listeria的特异性实验结果

2.4.5 Dynabeads anti-Salmonella特异性实验结果

2.4.6高菌液浓度的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌的免疫磁珠分选结果

2.4.7免疫磁珠分选水产品中单增李斯特菌、鼠防寒沙门氏菌的应用结果

2.4.8霍乱弧菌免疫磁珠的制备

2.4.9霍乱弧菌免疫磁珠分选菌体的条件优化

2.4.10免疫磁珠分选霍乱弧菌的应用

2.5小结

参考文献

3细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶双酶体系的应用

3.1引言

3.2实验仪器与材料

3.2.1实验仪器

3.2.2主要试剂与材料

3.2.3菌种

3.3实验方法

3.3.1胞内NADH提取方法的选择和优化

3.3.2双酶体系测定单位菌体胞内NADH含量

3.3.3双酶体系与与IMS联用进行纯菌检测

3.3.4双酶体系与IMS联用进行水产品中致病菌检测

3.4结果与讨论

3.4.1胞内NADH提取方法的确定

3.4.2不同培养时间菌体胞内NADH含量以及单位菌体内NADH含量的确定

3.4.3双酶体系与IMS联用纯菌检测结果

3.4.4双酶体系与IMS联用进行水产品致病菌检测

3.5小结

参考文献

4水产品样品前增菌研究

4.1引言

4.2实验仪器与材料

4.2.1实验仪器

4.2.2主要试剂与材料

4.2.3菌种

4.3实验方法

4.3.1菌悬液制备

4.3.2鱼肉样品的制备

4.3.3增菌液对单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌生长的影响

4.3.4单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌不同初始菌数的增菌

4.3.5其他各竞争菌在EB增菌液中的生长

4.3.6其他各竞争菌在SC增菌液中的生长

4.4结果与讨论

4.4.1增菌培养液对单增李斯特菌与鼠伤寒沙门氏菌生长的影响

4.4.2添加不同初始菌数的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌的生长

4.4.3其他各竞争菌在EB培养基中的生长

4.4.4其他各竞争菌在SC培养基中的生长

4.5小结

参考文献

5论文总结

6论文的创新性

7后期工作展望

致谢

个人简历及论文发表