荧光定量PCR检测哈维氏弧菌活的非可培养状态过程中的基因表达

摘要

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是广泛存在于海洋环境中的一种发光性革兰氏阴性菌,也是引起海洋动物弧菌病的重要条件性病原菌,能够感染多种海洋脊椎动物和无脊椎动物。活的非可培养状态(Viable but nonculturable state,VBNC)指细菌处于不良环境时细胞缩成球形,用常规方法培养时不能生长繁殖,但仍然具有代谢活性及致病力的一种特殊存在形式。在适当条件下VBNC状态的细菌能够恢复为可培养状态。已有研究发现,哈维氏弧菌在低温寡营养条件下能够进入VBNC状态。本论文建立了检测哈维氏弧菌基因表达的荧光定量PCR方法,研究了热激和冷激条件下。Vhh、hsp、cysS、oppA、MnSOD和rpoS基因的表达,并进一步研究哈维氏弧菌从诱导进入VBNC状态到完成复苏的整个过程中,这几种基因表达的动态变化。
　　 哈维氏弧菌SF-1置于40℃水浴中进行热激处理,处理时间分别为0min、10min、20min、30min、50min。对各处理样品进行荧光定量PCR的结果显示,hsp基因在热激处理时表达量明显增加,热激处理前期表达量的增加尤其显著。MnSOD基因在热激10min时表达量升高为原来的9.641倍,随后逐渐下降,到50min时其表达量大致恢复到正常水平。oppA基因的表达量随着热激时间的延长有明显下降趋势。Vhh、cysS和rpoS基因的表达量在热激过程前期略有升高,随后明显下降。
　　 哈维氏弧菌SF-1置于4℃冰箱中进行冷激处理,处理时间分别为0h、1h、2h、4h、8h、12h。对各处理样品进行荧光定量PCR检测发现,在冷激处理过程中vhh基因和cysS基因的表达量呈下降趋势。oppA基因表达量没有明显的规律性。MnSOD、rpoS和hsp基因的表达在整个冷激过程中明显增加。
　　 哈维氏弧菌SF-1接种在人工海水中进行低温(4℃)培养,结果发现它在低温寡营养条件下诱导84d时进入VBNC状态。应用荧光定量PCR的方法,对哈维氏弧菌VBNC状态诱导及复苏全过程中6个毒力相关和应激相关基因的表达水平进行动态检测。发现在低温诱导前期rpoS、cysS和vhh基因表达量均比正常状态增加,随着低温诱导时间的延长,3种基因的表达量逐渐减少,进入VBNC状态后rpoS、cysS和vhh基因的表达量分别下降为原来的0.037倍、0.055倍和0.232倍,复苏后rpoS基因表达量约为正常状态时的0.674.倍,而cysS基因和vhh基因表达量则均恢复到正常水平。Hsp、oppA和MnSOD基因表达量在低温诱导过程及进入VBNC状态后均呈下降趋势,复苏后这三种基因的表达量分别为正常时期的1.765倍、0.232倍和2.593倍。进入VBNC状态时毒力相关基因的表达量降低,但复苏后大多能恢复到正常水平,可能是哈维氏弧菌复苏后保持致病性的重要原因之一。

目录

文摘

英文文摘

0 前言

1 荧光定量PCR检测哈维氏弧菌基因表达方法的建立

1.1 材料与方法

1.1.1 实验菌株

1.1.2 培养基与人工海水的配制

1.1.3 主要试剂

1.1.4 实验仪器

1.1.5 引物设计与合成

1.1.6 哈维氏弧菌的基因克隆

1.1.7 双标准曲线的制作

1.1.8 哈维氏弧菌待测样品的制备

1.1.9 荧光定量PCR反应及数据处理

1.2 结果与分析

1.2.1 哈维氏弧菌的引物序列

1.2.2 荧光定量PCR产物的特异性

1.2.3 哈维氏弧菌的基因克隆结果鉴定

1.2.4 标准曲线及相关系数

1.2.5 哈维氏弧菌总RNA的提取与纯化结果

1.3 讨论

2 环境应激对哈维氏弧菌基因表达的影响

2.1 材料与方法

2.1.1 实验菌株

2.1.2 热激处理

2.1.3 冷激处理

2.1.4 荧光定量PCR检测及数据处理

2.2 结果与分析

2.2.1 热激处理对哈维氏弧菌基因表达的影响

2.2.2 冷激处理对哈维氏弧菌基因表达的影响

2.3 讨论

3 哈维氏弧菌进入VBNC过程及复苏后基因表达动态变化

3.1 材料与方法

3.1.1 实验菌体

3.1.2 实验水体及培养容器

3.1.3 哈维氏弧菌VBNC状态的诱导及复苏

3.1.4 荧光定量PCR待测样品的制备

3.1.5 荧光定量PCR反应及数据处理

3.2 结果与分析

3.2.1 哈维氏弧菌SF-1在低温寡营养状态下的存活曲线

3.2.2 低温诱导VBNC及其复苏后哈维氏弧菌的基因表达

3.3 讨论

4 小结

参考文献

致谢

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