酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油三酯的工艺

摘要

以DHA和EPA为代表的n-3多不饱和脂肪酸在人体的营养、发育和健康等方面起着重要作用。DHA和EPA食用的最好形式为甘油三酯，但是天然甘油三酯型鱼油中DHA和EPA含量较低，本文利用生物酶法催化酯交换反应制备含DHA和EPA含量在45％的甘油三酯，主要研究内容如下：
　　 1测定了包括脂肪酶J、U、P、T、B、L、M、N、Lipozyme TL IM和LipozymeRM IM在内的10种脂肪酶的含水量和水解酶活，并建立了在无溶剂体系中测定脂肪酶酯交换酶活的方法，在此基础上比较了各脂肪酶的酯交换酶活。在10种脂肪酶中，来自褶皱假丝酵母(Candida Rugosa)的脂肪酶M水解酶活最高(为4702.7 U/g)，其次为脂肪酶L，Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM的水解酶活分别为356.7 U/g和407.2 U/g。酯交换酶活的测定以正辛酸乙酯和三油酸甘油酯为底物，反应条件为：正辛酸乙酯和三油酸甘油酯的质量比为1:1，脂肪酶添加量为1％(占底物总质量)，反应温度为60℃，反应时间为2h。利用该方法测得脂肪酶M的酯交换酶活最高，大约是常用于催化酯交换反应的Lipozyme RM IM的两倍。因此选用脂肪酶M作为酯交换反应的催化剂，制备含45％DHA和EPA的甘油三酯。通过对脂肪酶水解活力和酯交换活力的比较，发现脂肪酶的水解活力与酯交换活力之间的相关性不高。
　　 2建立了一种正相高效液相色谱.蒸发光散射检测器联用的方法，用于测定鱼油中甘油酯组成。色谱柱为Rx-SIL型正相硅胶色谱分析柱(250mm×4.6mmi.d.，5μm)，柱温为35℃；流动相为正己烷-异丙醇-乙酸(90:10:0.2，V/V)，流速为0.8mL/min；蒸发光散射检测器漂移管温度60℃，载气流速1.4L/min，可在12min内完成一个样品的测定。标准品的色谱峰与进样质量成线性关系，峰面积变异系数小于1.5％，最低检出限为0.02-0.05μg，加标回收率为98.25％-103.08％。该方法可以较为快速准确地测定甘油酯混合物中甘油三酯、甘油二酯和单甘油酯的含量，而不受脂肪酸组成的影响。
　　 3利用筛选出的脂肪酶M催化酯交换反应，在无溶剂体系中制备DHA和EPA含量达45％的甘油三酯。首先比较了酯交换反应中酸解和酯-酯交换反应的优缺点，在相同的反应条件下，酸解反应的速度略快于酯-酯交换反应。综合考虑酸解反应和酯-酯交换反应工艺过程的优缺点，选择酯-酯交换法用于制备EPA和DHA总含量在45％的甘油三酯。利用鱼油乙酯和甘油三酯(EPA和DHA含量为28.87％)作为底物，考察了温度(40℃-70℃)、反应时间(6-60h)、加酶量(40-200U)、底物质量比(2:1-1:3)、加水量(0.5％-8％)以及乙酯鱼油中EPA和DHA的含量对酯交换反应的影响，通过正交试验发现，在选定的因素水平范围内，反应时间对酯交换结果的影响最大，其次是加酶量，对酯交换反应影响最小的是底物质量比，得到的较优的工艺条件为：反应温度60℃，反应时间24h，底物质量比为5:4，加酶量为80U，不向反应体系中加入水分。在该条件下酶反应得到的甘油三酯中EPA和DHA的含量分别为32.40％和13.10％，在该条件下脂肪酶重复利用7次仍能达到工艺目标。通过对底物与产物中EPA和DHA的含量的变化可推断出在无溶剂体系中，脂肪酶M对EPA的选择性大于DHA。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 n-3多不饱和脂肪酸的生理活性

1.1 防治心血管疾病

1.2 抗癌作用

1.3 抗炎作用

1.4 促进神经系统和视觉系统的发育

2 多不饱和脂肪酸的富集方法

2.1 物理化学法

2.2 酶法制备n-3多不饱和脂肪酸甘油酯

3 研究目的和内容

参考文献

第二章 酯交换脂肪酶的筛选

引言

1 实验材料与设备

1.1 实验材料

1.2 实验仪器

2 实验方法

2.1 脂肪酶水分含量的测定

2.2 脂肪酶水解酶活的测定

2.3 无溶剂体系脂肪酶酯交换能力的比较

3 结果与讨论

3.1 脂肪酶的含水量

3.2 脂肪酶的水解酶活

3.3 脂肪酶的酯交换酶活

4 本章小结

参考文献

第二章 甘油酯的高效液相色谱法测定

引言

1 实验材料与仪器

1.1 化学试剂

1.2 实验仪器

2 实验方法

2.1 HPLC分析体系选择

2.2 ELSD参数设置

2.3 标准品溶液配制

2.4 定性测量

2.5 标准曲线的制作和最低检出限的测定

2.6 精密度试验

2.7 加标回收率试验

2.8 样品的测定

3 结果与讨论

3.1 各标准品的定性测定

3.2 油酸酯标准曲线

3.3 精密度实验

3.4 油酸酯的加标回收率

3.5 样品的检测

4 本章小结

参考文献

第四章 酶法提高甘油三酯中EPA和DHA含量的工艺

引言

1 实验材料与设备

1.1 实验材料

1.2 实验仪器

2 实验方法

2.1 原料鱼油的组成测定

2.2 酯交换方法的比较

2.3 单因素实验

2.4 正交试验

2.5 脂肪酶的重复利用

2.6 产物分析

3 实验结果与讨论

3.1 酯交换方法的比较

3.2 单因素实验

3.3 正交试验

3.4 反应前后脂肪酸组成的比较

3.5 脂肪酶的重复利用

4 本章小结

参考文献

总 结

个人简历

学术成果

致谢