牙鲆HSP70与HSC70基因的克隆、表达及其SNPs与耐热性状的相关性分析

摘要

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是重要的海水养殖鱼类,其肉质细嫩,味道鲜美,营养丰富,深受消费者喜爱。我国的牙鲆增产养殖业从20世纪80年代开始得到了迅猛发展。然而,牙鲆养殖业的发展也带来了诸多不容忽视的问题,随着工厂化养殖规模的扩大、养殖环境不断恶化、以及牙鲆的高繁殖能力使得国内大部分养殖基地亲本繁育群体过小和更换率过低,导致牙鲆养殖群体遗传多样性的降低,使得现在养殖的牙鲆出现疾病爆发频繁、死亡严重、养殖效益大幅下降的情况。因此急需培育生长速度快,抗病能力高、抗逆性强的牙鲆新品种来满足当前养殖业的迫切需要,为此做了以下工作:
　　 1.牙鲆的选育效果评估
　　 为了评估牙鲆(Paralhzhthys olivaceus)人工选育的育种效果,以2007年经过家系选育的具有优良生长性状的第一代个体为亲本,依据巢式交配设计,构建了第二代10个半同胞家系和20个全同胞家系。在养殖4个月后进行生长性状的测定,对比测试结果表明,经过选育的群体的平均体质量比未经选育的对照组提高了2.91克,遗传增益为11.25％,显著高于未经选育的群体；经过选育的群体全长极显著显著高于未经选育的群体,全长的遗传增益较未选育的群体提高了1.33厘米,遗传增益为10.36％。初步达到了改良生长性状的效果。体重、全长和体高的遗传力为分别为0.656～0.731,0.481～0.742,0.480～0.651,均属于高等遗传力,显示牙鲆选择育种仍旧可以取得较快的遗传进展,具有较大的选择潜力。
　　 2.Hsp70与Hsc70基因的克隆及表达分析
　　 Hsp70是热休克反应(heat shock reaction,HSR)中生成最为显著、最主要的一种应激蛋白。它能通过分子伴侣作用与蛋白分子结合,保护新合成蛋白分子的正确构型并参与蛋白分子在细胞内的转运和组装；当蛋白受损变性时,能促使其恢复,或加速其降解与清除；能重新激活某些酶,以维护细胞的功能和生存。研究表明,Hsc70属于结构型蛋白主要存在于正常细胞,而Hsp70仅出现在应激细胞,且在细胞受到应激时增加明显。
　　 本研究克隆获得了牙鲆热休克蛋白Hsp70及其同源蛋白Hsc70的基因cDNA和DNA全长,并对二者在热激条件下的表达情况进行了分析。
　　 Hsp70的cDNA总长为2006bp,包括5’UTR109bp,3’UTR160bp以及编码区1923bp,可编码640个氨基酸。DNA总长2646bp,其中编码区内无内含子,位于编码区5端外侧含有一个符合GT-AG规则的长454bp的内含子。Hsc70的cDNA总长为2068bp,包括5’UTR60bp,3’UTR31bp以及编码区1953bp,其ORF编码650个氨基酸。Hsc70基因DNA全长3046bp,序列包括8个外显子,7个内含子。
　　 方差分析表明,在牙鲆的心肌细胞中,正常条件下(0h),Hsp70几乎不表达,当瞬时的热激处理后,hsp70开始大量表达,并随着热胁迫时间的增加表达量逐渐降低,到达8小时的时候几乎不表达。
　　 在未经热处理的对照组中(0h),Hsc70大量表达。在热休克开始之后,其表达很快受到抑制,表达量几乎为0,在此后的8个小时内几乎都没有表达的情况发生。同时发现2个具有耐热表现型差异的家系之间Hsp70的表达情况没有差异,Hsp70的表达情况与家系之间也没有交互作用发生。
　　 3.HSP70的SNP位点与牙鲆耐热性状的关联分析
　　 扩增并测序了60条筛选出来的具有耐热性状差异的牙鲆群体Hsp70基因(相对耐热与不耐热牙鲆各30尾),测序和筛查结果共发现了24个SNP位点,其中的12个位于非翻译区,12个位于翻译区。在这24个位点中,同义突变有23个,占总数的96％,而非同义突变只有1个,且为同类型氨基酸。经过检验分析,最终将ID为1、2、5、8、15号的SNP作为下一步验证与耐热相关性的待选类型。