筛选耐热性奶牛的HSP70AlA基因SNP位点、应用及试剂盒

摘要

本发明涉及一种筛选耐热性奶牛的SNP位点及检测方法，所述SNP位点为奶牛HSP70A1A基因第6400位、第6600位和第6601位碱基。通过提取奶牛的基因组DNA，测定奶牛热休克蛋白70A1A(HSP70A1A)基因单倍型组合，预测奶牛的耐热性：HSP70A1A基因单倍型组合为H2H3时，奶牛的耐热性最强；HSF1基因单倍型组合为H2H4时，奶牛的耐热性最差。本发明的优点是：首次阐明了HSP70A1A基因3个多态性位点组合与奶牛耐热性的相关性，提供了一种预测奶牛耐热性的方法，还提供了用于该方法的试剂盒，为奶牛的标记辅助选种和选配提供了新的分子标记方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选耐热性奶牛的SNP位点，具体地说是利用HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位碱基多态性预测奶牛耐热性，属于家畜分子生物学技术领域。

背景技术

奶牛热应激指当奶牛受到超过本身体温调节能力的过高温度刺激时，作用于垂体-肾上腺皮质系统引起机体的非特异性防御反应和特异性障碍的全身性适应症。我国饲养的奶牛品种大多是来源于北欧的荷斯坦牛，此品种产奶性能高，体型大，相对散热面积小，汗腺机能不发达，不能很好地利用皮肤散热，在产乳和新陈代谢过程中的热量大，且该品种奶牛的采食量大，饲料在瘤胃中发酵而产生大量热量。温度、品系、泌乳阶段、胎次等对奶牛耐热性也有一定的影响。随着全球气候变暖，我国夏季高温时间逐渐加长，使牛特别是奶牛夏季容易发生热应激。奶牛机体长时间处在热应激的环境中，可导致机体的免疫力下降。高温不同程度地降低了机体细胞免疫和体液免疫的能力，有利于病原微生物的孳生繁殖，使奶牛对疾病抵抗力降低。因而，乳腺炎、胎衣不下和子宫内膜炎增加。热应激可导致奶牛新陈代谢紊乱，采食量减少，生产性能下降，繁殖力降低，免疫力降低，易感染乳腺炎、胎衣不下、子宫内膜炎等疾病，严重时可导致中暑，甚至死亡。奶牛热应激已成为目前困扰我国奶牛养殖业的头号难题。奶牛的最适生活温度是-1℃-15℃。在21℃以上，气温每升高0.6℃奶牛采食量下降1.4kg，致使机体营养摄入量不足，此时温度每升高1℃，产奶量下降0.18kg-0.68kg。据报道，按持续高温90天计算，一头产奶量中等的万头牛场，因热应激造成的经济损失就达36.5万元(屈军梅，李文平.2005)。

目前，红细胞钾是比较公认的评定奶牛耐热性指标。红细胞钾的研究工作源于绵羊，Evans(Evans.1954)首次发现了英国品种绵羊个体间的差异，并划分为高钾(HK)和低钾(LK)两个类型，随后，证明成年牛同一个体在不同时期中红细胞钾含量相对恒定，且LK型容易适应酷暑和干旱的环境(Evans，Mounib.1957)。Evans(1963)在这一启示下开始研究婆罗门公牛、短角牛、南非瘤牛和海福特牛等及其杂种，发现耐热性最强的南非瘤牛和婆罗门公牛红细胞钾含量最低，故认为其可作为牛耐热性的可靠指标。Comberg(1969)用3对同卵荷斯坦孪生犊牛证明了这一结果，并阐明孪生对内差异不显著，而各对间存在差异。穆玉云(1993)等在南京的试验验证了相同环境条件下耐热奶牛和不耐热奶牛红细胞钾含量差异显著。近年来研究表明，红细胞钾与耐热性呈负相关，不受性别与年龄的限制，遗传力高，测定简单，重复率高，可作为耐热性遗传标记物(史彬林等.1993)。荷斯坦牛不同场别、不同胎次、不同产犊月份红细胞钾含量差异不显著，证明红细胞钾含量基本稳定，不受营养、生理和环境因素影响，是由遗传因素决定的(穆玉云.1990)。这与曹靖宝(1997)、赖登明(1997)、刘玉庆(1997)等的研究结果一致。

1962年Ritossa首次发现在热环境中基因转录增强，1974年Tissiereso利用SDS-PAGE分离得到热应激反应产生的一组新蛋白质-HSP。随后，研究发现HSP70是HSP家族最重要的一组蛋白质。热休克蛋白70(Heat shock protein 70，HSP70)作为最为重要的分子伴侣参与动物的热应激反应，通过其分子伴侣作用参与新生蛋白质折叠、转运、损伤蛋白质的修复、异常聚集蛋白质的降解，抗原呈递等许多重要体内过程，从而在生物体正常和应激条件下发挥重要作用。大量研究表明，HSP70家族与耐热性的获得有关，其能使热诱导的变性蛋白尽快恢复自然状态(Bosch等，1988；Morimoto等，1990；Sanchez等，1993；Maloyan等，1999)。动物在热应激时，机体内HSP70迅速被诱导(鲍恩东等，2004)，随着HSP70表达增强，机体对热的耐受能力增强(Krobitsch etal.，2000)；给正常细胞转入HSP70基因，细胞耐热力增强。Zhen等(2006)研究发现，基因的突变影响动物的耐热性，具有某些特定基因型的动物的耐热性高。

随着分子数量遗传学的发展，关联分析成为研究功能候选基因的一种可靠方法，即利用候选基因多态性与能够说明某一性状的指标建立相关模型进行统计分析，从而找到显著影响某一性状的分子标记。如奶牛的体细胞评分(SCS)可作为奶牛乳腺炎水平的可靠指标，因此人们通过功能基因多态性与SCS进行关联分析就可得到显著影响奶牛乳腺炎抗性的分子标记。利用这种方法，人们在奶牛中得到了大量的乳蛋白、乳脂以及产奶量的分子标记。刘庆华、梁学武(2006)利用PCR-SSCP技术研究发现HSP70A1A基因5’侧翼区AC基因型耐热性能高于其他基因型。陈强(2007)推测HSP70A1A基因的A基因可能是耐热基因，B基因为不耐热基因。因此，我们进一步研究HSP70A1A基因SNP与奶牛耐热性状的关系，确定HSP70A1A基因耐热单倍型组合。

发明内容

本发明的目的提出一种用于筛选耐热性奶牛的HSP70A1A基因的SNP位点；

本发明的第二目的在于提出利用上述HSP70A1A基因SNP位点单倍型组合筛选耐热性奶牛的方法；

本发明的第三目的在于，通过上述单倍型组合与奶牛耐热性状的关系，进而提供一种新的筛选耐热性奶牛的试剂盒，为奶牛的标记辅助选择提供新的分子标记，可进行奶牛的早期筛选。

为实现上述目的，本发明的发明思路为：提出的一个新的奶牛HSP70A1A基因的单倍型组合H2H3(GCG/CTA)，是检测奶牛自GenBank Accession NoAY149619.1中第6400位脱氧核糖核苷酸是G还是C，第6600位脱氧核糖核苷酸是C还是T，第6601位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定所述奶牛在这3个位点的单倍型组合，然后通过单倍型组合确定耐热性状。

本发明具体技术方案如下：

一种筛选耐热性奶牛的SNP位点，所述SNP位点为奶牛HSP70A1A基因第6400位、第6600位和第6601位碱基。

所述奶牛HSP70A1A基因第6400位为G/C、第6600位为C/T和第6601位为G/A。

一种筛选耐热性奶牛的方法，所述方法为：提取奶牛基因组DNA，测定奶牛HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位碱基多态性，根据奶牛第6400位、6600位和6601位的单倍型组合预测奶牛的耐热性。

所述奶牛HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位基因单倍型组合为GCG/CTA基因型时，奶牛耐热性最强。所述奶牛HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位基因单倍型组合为GCG/CTG基因型时，奶牛耐热性最差。

所述单倍型组合按照如下方法确定：如果自GenBank Accession NoAY149619.1中第6400位脱氧核糖核苷酸是G，其纯合体的基因型为GG；如果第6400位脱氧核糖核苷酸是C，其纯合体的基因型为CC；它们的杂合体基因型为GC。如第6600位脱氧核糖核苷酸是C，其纯合体的基因型为CC；如第6600位脱氧核糖核苷酸是T，其纯合体的基因型为TT；它们的杂合体基因型为CT。如第6601位脱氧核糖核苷酸是G，其纯合体的基因型为GG；如第6601位脱氧核糖核苷酸是A，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为GA。3位点组合后发现6单倍型组合，即H1H1(GCA/GCA)、H1H2(GCA/GCG)、H2H2(GCG/GCG)、H2H3(GCG/CTA)、H2H4(GCG/CTG)和H4H4(CTG/CTG)。

上述筛选耐热性奶牛的引物具有序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的碱基序列。所述引物可以特异性扩增出含HSP70A1A基因的SEQ ID NO.1所示序列。

一种筛选耐热性奶牛的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为100头牛检测剂量，试剂盒的保存温度为-20℃，所述引物具有序列表SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的碱基序列；试剂盒组成如下：

120μL 10×PCR缓冲液；

24μL 10mM dNTP；

10μL 5unit/μL Taq DNA聚合酶；

10mM的上下游引物各24μL；

25mmol/L MgCl₂ 75μL；

1ml纯水。

所述试剂盒还包括与HSP70A1A基因第6400位、6600位和6601位突变结合的探针和识别HSP70A1A基因中第6400位、6600位和6601位突变的限制性内切酶。

所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

6400位G→C；6600位C→T；6601位G→A；

其中，核苷酸位置编号基于No.AY149619.1。

本发明提出了HSP70A1A基因第6400位、第6600位和第6601位SNP碱基位点用于制备筛选耐热性奶牛的试剂盒的新应用。

在实际应用中，本发明确定的耐热性状可作为奶牛育种的辅助选择标记。H2H3(GCG/CTA)单倍型组合个体的耐热性高于所述其他单倍型组合个体，H2H4(GCG/CTG)单倍型组合个体的耐热性低于所述其他单倍型组合个体。

本发明提供的检测奶牛HSP70A1A基因的H2H3(GCG/CTA)单倍型组合包括如下步骤：

(1)利用常规的苯酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，DNA样品被稀释成50ng/μl备用。

(2)PCR-SSCP技术检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

6400位G→C；6600位C→T；6601位G→A；

其中，核苷酸位置编号基于GenBank索引号：AY149619.1。

(3)针对3个突变设计奶牛HSP70A1A基因特异性引物，进行PCR反应，得到特定片段(如序列表SEQ ID NO：1所示)的扩增产物，所述的扩增产物长度为549bp。

(4)PCR-SSCP技术检测扩增产物6400位单核苷酸多态位点G/C、6600位单核苷酸多态位点C/T和6601位单核苷酸多态位点G/A的多态性。PCR-SSCP的电泳图谱若得到条带1、3，其单倍型组合为H1H1；若得到条带1、2、3和4，其单倍型组合为H1H2；若得到条带2、4，其单倍型组合为H2H2；若得到条带1、3、5和6，其单倍型组合为H2H3；若得到条带2、4、5和6，其单倍型组合为H2H4；若得到条带5、6，其单倍型组合为H4H4。

(5)共分离鉴定出6种单倍型组合，对于本领域普通技术人员来说，单倍型的构建方法可以根据需要而改变，只要适合检测本发明的单倍型即可。

本发明的优点及有益效果：

(1)在奶牛HSP70A1A基因6400位、6600位和6601位鉴定出3个突变位点，并分离鉴定出一个单倍型组合H2H3，经国际基因组数据库和文献专利检索，证明为新的SNP和单倍型组合。

(2)经将上述的单倍型组合与奶牛群549头中国荷斯坦牛个体的耐热性状进行相关性分析，新分离鉴定出的一个单倍型组合H2H3与奶牛耐热性状显著相关，可以用于奶牛的早期筛选，从而减低饲养成本，增加产品的附加值。

(3)所发明的试剂盒只用一次SSCP电泳就可检测3个突变位点，简单方便，可用于早期检测以提高检测效率，降低检测成本。

附图说明

图1为奶牛HSP70A1A基因不同单倍型组合PCR-SSCP分型结果；

图2为奶牛HSP70A1A基因不同单倍型组合测序结果。

具体实施方式

本发明针对中国荷斯坦牛HSP70A1A基因进行了深入的研究，发现3个新的SNPs位点，针对这3个SNPs位点组成的单倍型组合进行分析，其中统计分析结果显示，奶牛HSP70A1A基因的单倍型组合H2H3的红细胞钾浓度显著低于H2H4，单倍型组合H2H3为耐热单倍型组合，H2H3单倍型组合个体的耐热系数显著高于H2H4和H4H4单倍型组合(P＜0.05)，其产奶量下降率显著低于不耐热的H2H4单倍型组合个体，进一步说明其为耐热单倍型。因此这个单倍型组合可作为检测奶牛耐热性状的特异性单倍型组合，用于奶牛的标记辅助选种和选配。在此基础上完成了本发明。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1单倍型组合及突变位点的确定

本发明采用PCR-SSCP和PCR测序技术对奶牛HSP70A1A基因突变进行筛查，通过SSCP电泳条带分析及测序结果比对，确定了6400位、6600位和6601位3个突变位点，6种单倍型组合。

1.1采集奶牛颈静脉血液(本发明所使用的荷斯坦牛颈静脉血液取自山东省规模化牛场，包括济南佳宝、青岛奥新苑、泰安金兰。即本发明所用血样的直接来源和原始来源)，ACD抗凝，利用常规的苯酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，DNA样品被稀释成50ng/μL备用。实验牛共540头，来自山东省内的规模化奶牛场。

1.2引物设计：

根据Genbank登录号为AY149619.1的HSP70A1A的基因序列，用PrimerPremier5.0软件设计引物，所设计引物的序列、扩增产物的片段长度见表1。

表1PCR扩增所用的引物

1.3PCR扩增

12μL的反应体系：模板(50ng/μl)1μL，10mM的dNTP 0.24μL，10×PCRbuffer 1.2μL，10μmol/L上下游引物各0.24μL，25mmol/l MgCl₂0.75μL，Taq酶0.5U。

PCR反应条件：95℃变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min，16℃保存。

1.4SSCP分析及测序

PCR产物95℃变性10min后，立即置冰盒上放入-20℃冰箱中10min后进行点样，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TBE，150V，12h，银染显色，观察PCR-SSCP电泳图谱并拍照，判断分析HSP70A1A基因的多态性。

如图1所示，为奶牛HSP70A1A基因不同单倍型组合PCR-SSCP分型结果。PCR-SSCP的电泳图谱共发现6种单倍型组合，分别为H1H1(具有电泳条带1、3)、H1H2(具有电泳条带1、2、3和4)、H2H2(具有电泳条带2、4)、H2H3(具有电泳条带1、3、5和6)、H2H4(具有电泳条带2、4、5和6)和H4H4(具有电泳条带5、6)。

每种单倍型组合分别取3头个体的PCR产物经纯化后，用ABI 3770 DNA测序仪进行序列的判读和SNP确认。如图2所示，为HSP70A1A基因不同单倍型组合测序结果，测序分析表明，这6种单倍型组合在3个位点的单核苷酸情况为H1H1：GCA/GCA、H1H2：GCA/GCG、H2H2：GCG/GCG、H2H3：GCG/CTA、H2H4：GCG/CTG和H4H4：CTG/CTG。在HSP70A1A基因共发现4种单倍型，分别是H1(GCA)、H2(GCG)、H3(CTG)和H4(CTA)，单倍型频率分别0.2787、0.4065、0.1361和0.1787。本领域普通技术人员已知，上述单倍型的构建方法可以根据需要而改变，只要适合检测本发明的单倍型即可。

实施例2HSP70A1A基因单倍型组合与奶牛耐热性的相关

红细胞钾浓度的测定：牛尾静脉采血5ml，3000r/min离心10min弃去血浆。向红细胞中加入5ml生理盐水，7000r/min离心8min，重复洗三遍，准确吸0.5ml红细胞，注入小试管，标号冷藏，然后送山东省农科院中心实验室用原子吸收分光光度计测定红细胞钾含量。

耐热系数是Rhoad(1944)创立测定的，公式如下：耐热系数＝100-18(BT-38.3℃)其中BT为试验时测得的平均体温，38.3℃为牛的正常体温，18为体温变化改变为基本单位的系数，100为维持体温在正常体温的完全效率。

最小二乘方差分析采用SAS8.2(Statistical Analysis System)软件的ANOVA-Linear Models程序，建立下列模型，对红细胞钾离子浓度与基因型和单倍型进行最小二乘分析和显著性检验，其模型为：

Y_ijkl＝μ+G_i+E_j+S_k+P_l+e_ijkl

公式中Y_ijkl为第i个个体表型的记录值，μ为群体平均值，G_i为第i个个体的基因效应值，Ej为环境效应值，S_k为季节的固定效应，P_l为胎次的固定效应，e_ijk为随机位差。如表2所示。

表2奶牛HSP70A1A基因单倍型组合与耐热性各项指标的最小二乘分析(最小二乘均值±标准误，LSM±SE)

注：同一位点不同字母间的差异水平，a，b：(P＜0.05)；A，B：(P＜0.01)。

由表2可知，奶牛HSP70A1A基因H2H3单倍型组合个体的红细胞钾浓度显著低于H2H4(P＜0.05)，有研究表明奶牛血钾浓度与耐热性能成显著负相关，红细胞钾浓度越低耐热性能越强，H2H3为耐热单倍型组合。H2H3单倍型组合个体的耐热系数显著高于H2H4和H4H4单倍型组合(P＜0.05)，H2H3单倍型组合个体的产奶量下降率显著低于不耐热的H2H4单倍型组合个体(P＜0.01)，进一步说明H2H3为耐热单倍型组合。这在奶牛选育和品种改良上具有潜在的应用价值。据此，育种工作者可以指导牛的早期筛选，从而降低饲养成本，增加产品的附加值。可见，奶牛HSP70A1A基因单倍型组合在奶牛的标记辅助选种和选配中有重要的应用前景。因此这个单倍型组合可作为检测奶牛耐热性状的特异性单倍型组合。

实施例3检测试剂盒

基于HSP70A1A基因单倍型组合标记筛选奶牛的试剂盒，如实施例1所述，AY149619.1中的6400位G→C、6600位C→T和6601位G→A突变构建的单倍型组合与奶牛的耐热性状密切相关。因此，可基于这3个SNP位点设计HSF1基因特异性引物进行扩增和检测。

制备检测奶牛耐热性的试剂盒(100次)，组成如下表3所示：

表3

具体组成及用量为：120μL 10×PCR缓冲液，24μL 10mM dNTP，10μL(5unit/μL)Taq DNA聚合酶，10mM的上下游引物各24μL，25mmol/L MgCl₂75μL，1ml纯水。

采集牛血液，提取总DNA，按实施例1所述方法进行反应。将试剂盒中的PCR引物稀释到1μmol/L，以所提取的DNA为模板用上述试剂盒进行PCR反应。PCR反应条件：95℃变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸7min，16℃保存。按实施例1所述方法对扩增产物单倍型组合进行确认。

应用检测试剂盒对100头奶牛进行检测，有28头牛为H2H3单倍型，而这28头牛中有27头牛为耐热型(耐热系数＞80，产奶量下降率低于25％)，因此本发明试剂盒准确性可达96％以上。

根据本发明提供的标记方法，如果用AY149619.1中的6400位C、6600位和6601位突变结合的探针或直接测序也可以检测出AY149619.1中第6400位G→C、6600位C→T和6601位G→A突变。

本发明具有实用性的例证：

1)本发明的HSP70A1A基因多态性的检测方法可用于分析牛23号染色体的HSP70A1A基因上的3个SNPs位点，应用于牛耐热性的早期诊断，以利于培育耐热牛品种。

2)本发明建立的检测HSP70A1A基因多态性的核苷酸序列和耐热性相关位点，可高灵敏度、特异性地应用于牛耐热性基因诊断的试剂盒。

如上所述，得出结论，HSP70A1A基因在第6400位C、6600位和6601位碱基的多态性与牛耐热性具显著相关性。因此，根据本发明，测定此多态性可用于进行基因诊断。

本发明叙述了HSP70A1A基因耐热性相关的新突变位点，并提供了一种测定HSP70A1A基因多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定HSP70A1A基因3个位点多态性。结果，本发明提供了一种测定牛耐热性相关单倍型组合的基因诊断方法。

序列表

<110>山东奥克斯生物技术有限公司

<120>一种用于筛选奶牛耐热性的HSP70A1A基因单倍型组合及其应用

<160>3

<210>1

<211>549

<212>DNA

<213>牛(Bos Taurus，bovine)

<400>1

TAAAGCCACC ACGATGTTTC AGCCAAAGTT GAGAAAAACC ACTGTACCAG AGGCTATTCC 60

TGATTATTTT TTAGAGGTAT GGGGACAAGA GAGAGGGAGG AGAGGAAGGT GTTAGTGCTT 120

CCAGGAGCAG CAGCTGGTGG CAAGGGATTT TCTGCTGTGA ATCAAAGCTG GAAAGGCCTT 180

AAAGTGTTGA TTCACTGGCA GCAGTAGTAA TGCTAAACTT TAGGGAAATT GCCACCAACA 240

GCTTAATAGG CCAAAAAAGA GAATTCCTGA AGCTGGGTCA ATTAATTTCA TGAGTCCTCA 300

CTAGGGAAAT GGCTCATTAG AAAGCAACAT CAGGGCGTCA TTTCCTGGCC CTCCAGCGGT 360

TAGGACTCAG TGCTTTCATT GCCAGGGCCT GGGTTCGATC CCTGGTGGAA GTAAAATCCC 420

ACAAGCAGTG AGGCTTAGCC AAAGTAATTA ACACAGAACT TACAAAAAAA AGATATGAGC 480

CATGGAGGAG TTCGCTTGCT TAGGAGCCTT GCCCATGGAG AATTGTGGAT GATTGCGGTG 540

GAACCTTCA                                                         549

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

TAAAGCCACC ACGATGTT                                    18

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

GGGGTAAGTC TGGTTACGAC                                  20