羽藻和缘管浒苔提取物对酪氨酸酶活性抑制作用的研究

摘要

酪氨酸酶(EC.1.14.18.1)是一种广泛分布于微生物、动植物以及人体当中的与黑色素形成相关的酶。酪氨酸酶在生物体中具有单酚酶活性和二酚酶活性,单酚酶活性能将单酚加氧形成二酚,多酚酶活性能将二酚等多元酚氧化形成醌,这些醌类物质多聚化,再与细胞内蛋白相互作用最后形成黑色素。酪氨酸酶对于生物体黑色素的形成以及外来物入侵时获得性免疫反应的产生有至关重要的作用。从天然海藻中筛选具有高效抑制活性的酪氨酸酶抑制剂可以应用于色素型皮肤病的治疗,研发美白化妆品、生物农药和食品添加剂等。
　　 本实验对11种海洋藻类进行了酪氨酸酶抑制活性的筛选,研究了羽藻和缘管浒苔提取物对酪氨酸酶的抑制作用。通过正交试验确定了这两种海藻提取物的最佳提取条件,采用有机溶剂萃取分离出两种海藻提取物的不同组分,通过动力学学方法分析对酪氨酸酶的抑制作用类型和机理,相关研究内容及结果如下:
　　 1.对11种海洋藻类进行了酪氨酸酶抑制活性的筛选。筛选体系总体积为5mL,底物多巴含量为1.0mmol／L,磷酸缓冲液pH值为6.8,酪氨酸酶液的终浓度为1.28ug／mL,抑制物终浓度为4mg／mL,反应温度为37℃,测试反应时间为1min。结果表明,在4mg／mL的提取物浓度条件下,红藻门的叉枝藻、真江篱、蜈蚣藻、珊瑚藻、鸭毛藻和扇形拟伊藻对酪氨酸酶有不同程度的抑制作用,抑制活性均高于20％。其中叉枝藻和真江篱对酪氨酸酶的抑制率达40％以上,绿藻门的羽藻、孔石莼、缘管浒苔对酪氨酸酶表现出不同程度的抑制作用,其中羽藻的抑制率最高,达78％,其次是缘管浒苔40.24％,红藻门的细枝软骨藻和褐藻门的角叉菜对酪氨酸酶则表现为反向激活作用,激活率分别为18.18％和20.45％。
　　 2.采用恒温水浴浸提法对羽藻和缘管浒苔的化学成分进行了提取,浸提溶剂为乙醇溶液、浸提料液比为1:12,浸提温度为40℃。首先通过单因素实验确定单个浸提条件的最佳值,然后利用正交实验确定出最佳的浸提条件组合。羽藻的最佳浸提条件组合为:60℃恒温水浴、60％的乙醇浓度、5h的浸提时间和1:14的料液比；缘管浒苔的最佳浸提条件组合为:60℃恒温水浴、60％的乙醇浓度、5h的浸提时间和1:10的料液比。
　　 3.将两种海藻的乙醇浸提物经有机溶剂萃取依次得到乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物和水溶性组分,分别测定三种组分的抑制活性、抑制类型和多酚含量。结果表明:羽藻石油醚组分对酪氨酸酶的半抑制浓度IC50为2.1mg／mL,属于非竞争性可逆抑制,抑制常数为KI=0.33；羽藻乙酸乙酯组分对酪氨酸酶的半抑制浓度IC50为,0.27mg／mL,属于非竞争性可逆抑制,抑制常数为KI=0.13；羽藻水溶性组分对酪氨酸酶的半抑制浓度IC50为1.0mg／mL,属于竞争性可逆抑制,抑制常数为:KI=0.91。缘管浒苔石油醚萃取物对酪氨酸酶的半抑制浓度IC50为0.29mg／mL,属于竞争性可逆抑制,抑制常数为:KI=0.28；缘管浒苔乙酸乙酯组分对酪氨酸酶的半抑制浓度IC50为0.19mg／mL,属于非竞争性可逆抑制,抑制常数为KI=0.08；缘管浒苔水溶性组分对酪氨酸酶的半抑制浓度IC50为7.02mg／mL,属于竞争性可逆抑制,抑制常数为KI=2.95。羽藻乙酸乙酯组分对酪氨酸酶的抑制作用最强,缘管浒苔乙酸乙酯组分对酪氨酸酶抑制活性最高。