南极大磷虾(Euphausia superba)胰蛋白酶适冷性酶学性质及结构特征分析

摘要

南极大磷虾（Euphausia superba）是一种常年生活在极寒地带的甲壳动物，在进化过程中形成了一系列适应寒冷环境的机制，而胰蛋白酶作为催化生物体内代谢反应的主要物质在这种机制中又起到了关键作用。目前，已经有一些从其它动物体内提取的适冷酶的相关研究相继被报道。本文主要从酶学性质、荧光光谱及分子特征等方面对南极大磷虾（Euphausia superba）胰蛋白酶进行了研究，目的是为其作为功能物质的应用和开发提供理论依据。
　　本研究共分以下三个部分：
　　第一部分：南极磷大磷虾胰蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究。
　　以南极大磷虾头为材料经过粗提、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和 Sephacryl S100凝胶过滤层析后，获得了三种酶，分别命名为 S100-Ⅰ、DEAE-Ⅱ和DEAE-Ⅲ，其纯化倍数分别为7.463倍、11.483倍和12.086倍；经过SDS-PAGE，测得三种酶的分子量分别是27.16 kDa、26.71kDa和26.82 kDa；三种酶的最适酶活温度分别为40℃、45℃和40℃，并且随着温度的增加，酶活性逐渐降低；三种酶的低温稳定性均较好（25℃以下，12h内仍能保持85％以上的相对酶活性），35℃时，S100-Ⅰ的稳定性相对较弱，而在40~45℃之间，酶DEAE-Ⅱ表现出更好的温度稳定性；三种酶的催化效率（14.28,9.46,5.93）比牛胰蛋白酶（3.59）分别高4.0、2.6倍和1.7倍。
　　第二部分：南极大磷虾胰蛋白酶的内源荧光光谱及苯甲脒对其荧光淬灭作用的研究。
　　对三种酶进行内源荧光扫描，结果表明，三种酶S100-Ⅰ、DEAE-Ⅱ和DEAE-Ⅲ的荧光峰位都在345nm附近，并且都存在能量由Tyr无辐射的向Trp的转移；随着温度的增加，三种酶的荧光强度均呈现出规律性的降低。胰蛋白酶的特异性抑制剂苯甲脒对酶DEAE-Ⅲ的荧光淬灭最弱，DEAE-Ⅱ次之，S100-Ⅰ最强，并且随着苯甲脒浓度的增加，三种酶的荧光强度呈现有规律的降低。苯甲脒对酶S100-Ⅰ和DEAE-Ⅱ的淬灭属于静态淬灭，其与二者之间存在一系列相对独立的结合位点，强烈的相互作用最终使二者之间形成了复合物；而对酶DEAE-Ⅲ的淬灭则是动态和静态共同作用的结果。热力学参数的研究结果显示，相比之下，酶S100-Ⅰ的自由能变化（⊿G）最低而焓变化（⊿H）及熵变化（⊿S）最高，表明其催化活性最强，柔性最弱而温度的稳定性也最差，而酶 DEAE-Ⅲ的结果刚好相反，酶DEAE-Ⅱ居中。
　　第三部分：南极大磷虾分子结构特征分析。
　　提取南极大磷虾胰蛋白酶总RNA，克隆获得cDNA并分析cDNA基因及蛋白序列,比对不同种类动物胰蛋白酶序列。结果表明，动物胰蛋白酶氨基酸数目随着进化逐渐减小，不同类群有各自含量较多的氨基酸类型。甲壳动物胰蛋白酶分子直径较小，结构单一，但是酶功能多样；脊椎动物胰蛋白酶分子直径较甲壳动物的增大，结构多样性较多，但酶功能趋于单一。由于外周和活性中心部位附近精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸的不同，CAF-TRY、TTF-TRY和 CAC-TRY、TTC-TRY、HV-TRY的稳定性、柔性和反应耗能量差异显著，CAF-TRY、TTF-TRY或CAC-TRY催化常数（Kcat）升高或米氏常数（Km）降低，催化效率CAF-TRY、TTF-TRY>CAC-TRY>TTC-TRY、HV-TRY。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一章 前言

1 适冷酶的研究概况

2 适冷酶在应用中的研究

3、南极大磷虾胰蛋白酶研究进展

4 课题研究的背景、意义和前景

第二章 南极大磷虾（Euphausia superba）胰蛋白酶的分离纯化及其酶学性质的初步研究

1 实验材料与方法

2. 结果与分析

第三章 南极大磷虾（Euphausia superba）胰蛋白酶适冷性结构的荧光光谱研究

1 实验材料与方法

2. 结果与分析

3. 结论

第四章 南极大磷虾（Euphausia superba）胰蛋白酶适冷性结构的基因分析

1 材料与方法

2 实验结果

3讨论

4 结论

参考文献

致谢

个人简历

发表的学术论文