毛蚶天然多肽提取纯化及其体外抗氧化能力和抑制肿瘤活性的初步研究

摘要

毛蚶是我国重要海产经济贝类，其肉质鲜嫩、营养全面且具有一定的药用功效。目前罕见对毛蚶肉中的天然生物活性成分的研究，因此对其中天然存在的活性物质的提取及应用做出讨论，将为毛蚶的高值化利用提供基础和途径，并对挖掘其药用前景具有十分重要的意义。本论文以新鲜毛蚶肉为原料，对毛蚶肉中的天然多肽、蛋白，利用缓冲液浸提、硫酸铵梯度盐析得到毛蚶蛋白粗提物，再经过超滤和凝胶层析系统进一步分离纯化，得到三组不同分子量段的毛蚶天然多肽。分别采用高效液相色谱法和Tricine-SDS-PAGE电泳技术分析鉴定所得到的三组活性多肽的组成和分子量分布。最后对三组毛蚶多肽的体外抗氧化活性和抑制肿瘤细胞增殖能力做出了初步研究。
　　首先，进行了毛蚶肉中抗氧化活性蛋白提取的单因素试验。蛋白提取环境为磷酸盐缓冲液体系（PBS），考察了三个因素：PBS缓冲液的pH值、缓冲液中NaCl浓度、料液比对毛蚶蛋白提取率和O2-·、DPPH·自由基清除率的影响。通过单因素实验，确定最适提取条件是pH为7.0、NaCl浓度为0.05 mol/L、料液比为1:2。
　　其次，采用盐析法和超滤技术对毛蚶蛋白粗提物进行分级分离，并运用Sephadex G-15凝胶层析进行脱盐纯化。盐析结果表明，30~100％饱和度硫酸铵盐析下的提取物复溶性较好，且抗氧化活性较高。对此饱和度沉淀物复溶后通过截留分子量分别为30 kD、10 kD、3 kD的超滤膜，收集分子量段分别为Mw<3 kD、3 kD　　分别运用高效液相色谱法和Tricine-SDS-PAGE电泳技术对三组毛蚶多肽组分进行分子量分布的测定。HPLC实验结果表明：组分1的多肽由五部分组成，其分子量分布为440.59 Da、721.98 Da、1252.45 Da、1734.17 Da、3158.68 Da；组分2中主要由4部分组成，分子量分别约为4776.48 Da、5831.68 Da、7478.94 Da、9454.88 Da。电泳结果表明，组分3中的蛋白质分子量较小，范围在10~20 kDa。
　　最后，对纯化的三组毛蚶天然多肽进行了体外抗氧化活性和抑制肿瘤细胞增殖能力的初步探究。实验结果显示，组分1对超氧阴离子自由基和 DPPH·自由基的清除作用最好，样品浓度5.00 mg/mL时对两种自由基清除率分别达40.54%、28.66%。MTT实验结果显示：组分1对肝癌细胞HepG2增殖具有一定的抑制作用；组分2对肝癌细胞HepG2增殖存在潜在的促进作用，但必须达到特定浓度；组分3对肝癌细胞HepG2增殖没有明显影响。体外活性探究结果发现，毛蚶中提纯的分子量小于3kD的天然寡肽兼具良好的抗氧化活性和抗肿瘤活性，具有进一步开发的价值和意义，以及开发成新型海洋天然药物的潜力。
　　综上，本文首次对毛蚶中天然存在的小分子多肽进行了系统的分离纯化及活性的研究。提供了较为系统的毛蚶天然多肽的分离纯化步骤，证明了毛蚶天然小分子肽具备一定的抗氧化、抗肿瘤活性。本文结果为毛蚶多肽的深入研究提供了理论基础，并有望促进毛蚶在功能性食品药品领域综合利用的发展。

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0前言

0.1毛蚶的研究概况

0.2海洋生物活性物质研究概述

0.3本研究的目的意义和主要内容

第一章 毛蚶肉中天然活性蛋白提取工艺的研究

1.1材料与仪器

1.2实验方法

1.3实验结果与讨论

1.4本章小结

第二章 毛蚶肉天然活性肽的纯化、脱盐及鉴定

2.1 材料与仪器

2.2实验方法

2.3 实验结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 毛蚶天然多肽的体外抗氧化活性和抗肿瘤能力研究

3.1 材料与仪器

3.2 实验方法

3.3 实验结果与分析

3.4 本章小结

参考文献

主要结论

展 望

本论文创新点

个人简历

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢