土茯苓中落新妇苷的提取纯化及抗肾纤维化作用的研究

摘要

土茯苓是百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎，是临床上常用的传统中药材，含有多种活性成分。落新妇苷是土茯苓中含量最高的黄酮类成分，具有抗炎及抗氧化等作用。本论文研究了一种适合工业化生产的落新妇苷制备方法，通过结构鉴定确定为一水合落新妇苷，并对其对抗肾纤维化作用进行了的研究，主要内容包括以下几个部分：
　　（1）以落新妇苷为考察指标采用HPLC法对土茯苓的药材产地进行了筛选，确定药材产地为越南，建立了越南产土茯苓药材的HPLC特征图谱，为土茯苓的药材质量控制提供依据。土茯苓药材特征图谱中应有8个特征峰，与参照物相对应的峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间规定值为：0.54（峰1）、0、93（峰2）、1.18（峰3）、1.20（峰4）、1.26（峰5）、1.33（峰6）、1.62（峰7）。各个峰的相对保留时间应在规定值的±5％之内，其中峰5的相对峰面积为19.85％。
　　（2）以越南产的土茯苓为研究对象，通过L9(34)正交试验优化了落新妇苷的提取方法，采用大孔树脂柱层析的方法研究了落新妇苷的分离纯化工艺，最后确定落新妇苷的制备工艺为：土茯苓药材饮片加60%乙醇溶液20倍浸泡提取2次，每次12小时，合并提取液，浓缩脱醇，加样于AB-8型大孔树脂柱，先用10%乙醇洗脱去除杂质，再用40%乙醇洗脱落新妇苷，收集40%乙醇洗脱液部分，回收乙醇，浓缩，冷藏结晶，过滤，重结晶，干燥得到落新妇粗品，将落新妇苷粗品用10%乙醇溶解，再用AB-8大孔树脂吸附，先用15%乙醇洗涤，再用25%乙醇洗脱，收集25%乙醇洗脱液，浓缩至适当浓度，冷藏结晶，过滤，重结晶，减压干燥，得到落新妇苷样品，含量在95%以上。经过中试验证，该工艺操作简便、稳定可控，而且不使用有机溶剂，适合工业化生产。
　　（3）落新妇苷样品经过进一步柱层析纯化处理纯度达到99.8%，采用红外吸收光谱（IR）、紫外吸收光谱（UV）、1H-NMR、13C-NMR、二维NMR、1H-13C偶合谱（HSQC）和1H-13C远程偶合谱（HMBC）等手段确认了落新妇苷的化学结构，并通过高分辨质谱、元素分析、热分析和圆二色散证明了落新妇苷中含有一分子结晶水。
　　（4）通过建立不同的大鼠肾病模型，研究了落新妇苷的抗肾纤维化作用。首先选择了结晶沉积致大鼠慢性肾功能衰竭模型和残肾过度使用致大鼠肾功能衰竭模型；超过40%的糖尿病肾病患者会发展至终末期，因此也建立了糖尿病肾病模型，并与降糖药联合应用。将动物的高死亡率作为发展到终末期的重要标志，研究显示落新妇苷长期给药能够显著的降低动物死亡率。血清肌酐和尿素氮水平是临床上检测肾功能的重要指标，尿蛋白的排出量是临床检测糖尿病肾病和向终末期发展的重要标志，研究显示落新妇苷长期给药能够持续抑制血清肌酐、尿素氮、尿蛋白水平的升高。
　　实验证明，落新妇苷能明显降低肾脏纤维化大鼠尿素氮、肌酐水平、尿蛋白排泄量、尿量及肾肌酐清除率；显著提高大鼠的存活率；改善肾小管间质病理变化；降低TGF-β1和CTGF的表达，而且CTGF的减少和落新妇苷呈剂量关系，推测落新妇苷抗肾纤维化的机制可能和抑制CTGF的表达有关。
　　本论文的研究为落新妇苷治疗肾纤维化药品的开发提供了可靠的理论依据和研究基础。

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0.前言

0.1.药材基源研究

0.2.土茯苓药材概况

0.3落新妇苷的研究概况

0.4 肾脏纤维化与抗纤维化治疗研究

0.5本研究的目的和意义

1.土茯苓药材基源研究

1.1药材产地的筛选

1.2 土茯苓药材的特征图谱研究

1.3本章小结

2落新妇苷提取纯化工艺的研究

2.1落新妇苷的提取

2.2落新妇苷分离纯化

2.3 工艺的放大

2.4落新妇苷制备工艺流程图

2.5本章小结

3 落新妇苷化学结构确证

3.1. 化合物的化学结构、分子式及分子量

3.2. 用于确定化学结构的样品处理

3.3. 确定化学结构的方法

3.4 讨论

3.5 本章小结

4.落新妇苷的抗肾纤维化作用研究

4.1材料

4.2 实验方法

4.3数据分析与处理

4.5讨论

4.6本章小结

5.结论

5.1总结

5.2本文创新点

参考文献

附录

致谢

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