钝顶节旋藻高产藻株的诱变选育

摘要

节旋藻(Arthrospira)是一种有着较高经济价值的微藻,被世界粮农组织认为是21世纪人类最理想的食品。节旋藻自上世纪80年代引进我国以来,经过30多年的发展,节旋藻养殖及相关产业已经成为我国最大的微藻生物技术产业群。在节旋藻养殖的发展过程中,对优良种质资源的开发与利用一直是研究的重点。其中以诱变选育具有生长速度快、蛋白含量高等优良性状的节旋藻藻株,在工业生产中有实用意义。
　　为获得节旋藻高产藻株,本研究使用亚硝基胍诱变结合喹禾灵筛选的方法。喹禾灵(Quizalofop-Ethyl)作为一种乙酰辅酶A羧化酶抑制剂,通过抑制乙酰辅酶A羧化酶的活性,影响脂肪酸的合成,进而影响细胞的生长。在一定浓度喹禾灵中存活的藻细胞通常有着更高的酶活性,这种酶活性的提高可能来自于酶自身结构的改变,酶表达量的提高或者激发其他代谢旁支的代偿性活动。在撤去喹禾灵的筛选压力后,存活藻株可以获得脂质含量补偿性提高,有可能会出现具有优异性状的新品种。
　　本实验通过诱变与筛选获得了2株能够稳定遗传的高产突变株。与出发株相比,突变株生长速度提高,在形态上藻丝更长,更易聚集成团。
　　进一步对节旋藻出发株与2株诱变株的最佳培养条件进行探索,通过单因素实验与正交实验发现出发株与诱变株的最佳培养条件是 pH8.5,光照强度45mol·m-2·s-1,培养温度28℃,在最佳培养条件下突变株的生长速度分别比出发株提高67.86％和46.43%。蛋白含量分别比出发株提高1.98%和0.84%。脂质积累和乙酰辅酶A羧化酶活性最高的培养条件是pH8.5,光照强度70mol·m-2·s-1,培养温度28℃,在该条件下,脂类含量提高8.54%和4.88%,乙酰辅酶A羧化酶活性提高31.82%和11.36%。
　　在分子水平上对出发株与诱变株的乙酰辅酶A羧化酶进行研究。克隆并测序了乙酰辅酶A羧化酶四个亚基的ORF序列,分别是生物素羧化酶亚基、生物素羧基载体蛋白亚基、α-羧基转移酶亚基和β-羧基转移酶亚基,序列长度分别为981bp、948bp、723bp和536bp。四个亚基的序列均非常保守,通过序列比对发现出发株与筛选出的突变株乙酰辅酶A羧化酶4个亚基的ORF序列完全一致,且与Genbank中节旋藻全基因组测序结果相符,表明亚硝基胍诱变并未在诱变株乙酰辅酶A羧化酶4个亚基的ORF序列上造成突变。
　　综上所述,以亚硝基胍诱变结合喹禾灵筛选,可筛选出生长速度快、蛋白含量高等性状优良的节旋藻藻株,在工业生产中有实用意义。

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第一章 前言

1微藻的诱变与应用

1.1物理诱变

1.2化学诱变

2节旋藻诱变育种进展

3乙酰辅酶A羧化酶研究进展

3.1乙酰辅酶A羧化酶概述

3.2乙酰辅酶A羧化酶抑制剂

4. 论文的立项依据和研究目的

第二章 节旋藻的诱变选育

1材料与方法

1.1藻种及其培养

1.2主要仪器

1.3试剂及其配置

1.4实验方法

2实验结果

2.1节旋藻培养液吸光度-生物量关系的确定

2.2亚硝基胍诱变预实验

2.3喹禾灵筛选预实验

2.4突变株筛选

2.5出发株623，突变株623-8，突变株623-16的形态特征观察

2.6 出发株623，突变株623-8，突变株623-16的蛋白含量测定

2.7出发株623，突变株623-8，突变株623-16的总脂含量测定

3讨论

3.1随机诱变与定向选育

3.2 不同诱变手段的优劣和本实验对诱变剂的选择

3.3喹禾灵筛选高产藻株的原理

第三章 节旋藻突变株培养条件的优化

1材料与方法

1.1藻种及其培养

1.2主要仪器

1.3试剂及其配置

1.4实验方法

2结果与讨论

2.1单因子实验结果

2.2出发株与突变株的培养条件优化及正交实验结果分析

3讨论

第四章 乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆

1 材料与方法

1.1藻种及其培养

1.2主要仪器

1.3试剂及其配置

1.4实验方法

2实验结果与分析

2.1 ACCase各亚基ORF克隆结果

2.2 ACCase各亚基ORF测序结果与分析

总结

参考文献

致谢

个人简历