南极大磷虾脂肪酶提取纯化及其酶学性质研究

摘要

南极大磷虾是一类广泛分布于南极海域的多年生浮游甲壳动物,具有生物量大、分布广、营养价值高等特点,是重要的海洋蛋白新资源,同时,因其生活环境和方式的特殊性而具有产生新型生物活性物质的巨大潜力,因其潜在的渔业价值而日益受到重视。南极大磷虾生物活性物质包括酶、脂质、甲壳素、生物活性肽和紫外吸收物质等。在其体内具有非常高效的消化系统,当磷虾死后,消化酶迅速将磷虾的蛋白质、多糖等降解,这种高效的消化酶活性引起了人们的兴趣,现在已经对部分酶进行了纯化和性质研究工作。与此相对的,对其脂肪酶的研究工作尚未展开。而脂肪酶作为一种重要的工业用酶,在食品、化工、纸浆、饲料工业等领域广泛应用。其中,低温脂肪酶主要适用于如食品领域,医药,环保等。低温脂肪酶在低温下仍保持高酶活,因此在应用中有着中温脂肪酶无法取代的优越性,而具有高活性的低温脂肪酶因其具有理论和应用上的双重意义成为了近年来的研究热点。因此,对南极大磷虾脂肪酶进行分离纯化,酶学性质探索和生物学活性研究,具有一定的理论和应用价值。本文尝试分离纯化南极大磷虾脂肪酶并对其相关的酶学性质进行研究。
　　本文共有两部分:
　　第一部分:南极大磷虾脂肪酶分离纯化
　　实验中,酶活性测定方法采用不同碳链长度的两种人工底物pNPB(对硝基苯酚丁酸酯)、pNPP(对硝基苯酚棕榈酸酯)为实验底物。以南极大磷虾虾头为材料经过粗提、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephacryl S100凝胶过滤层析对其脂肪酶进行分离纯化。
　　在提取纯化实验中,发现水解pNPP的脂肪酶可能含量较少,采用35~80％的硫酸铵浓度盐析,实验只进行到离子交换层析,获得两个酶活性峰,纯化倍数达到6.59;水解pNPB类脂肪酶含量较大,采用50~80%的硫酸铵浓度盐析,离子交换层析及凝胶过滤柱层析均只有一个活性峰,最后经SDS-PAGE得到单一条带,说明经过一系列纯化步骤得到了较纯的样品,分子量约为42.81kDa,纯化倍数达到5.41。
　　第二部分:脂肪酶部分酶学性质研究
　　酶学性质研究实验对前期实验纯化所得的南极大磷虾水解pNPB类脂肪酶的部分酶学性质进行了研究。
　　反应温度对酶促反应速率的影响结果显示,在5℃~25℃范围内,该脂肪酶酶活力比较稳定,即使在5℃仍具有较高的酶活性,对较高温度稳定性差;在35℃具有最佳反应速率,具有低温脂肪酶的催化特性,这可能与其生活环境相关。
　　反应pH对酶促反应速率的影响结果显示,最佳反应pH为8.0左右;在4℃低温条件下,该酶具有较好的 pH稳定性,在 pH6~10范围内,酶活力都保持在60%以上。
　　不同浓度金属离子对酶促反应速率的影响结果显示,Mn2+(<0.5mmol/L)、Cu2+(≥0.1mmol/L)对南极大磷虾脂肪酶有一定的抑制作用,前者浓度达到5mmol/L时有轻微促进作用; Mg2+(≤0.4mmol/L)和 Ca2+(≤0.4mmol/L)对南极大磷虾脂肪酶有轻微的促进作用,但当浓度达到0.5mmol/L时,改为急促的抑制作用;K+在0~0.3mmol/L浓度范围时,对酶活力基本没有影响,但当浓度超过0.3mmol/L时,改为轻微的促进作用;Zn2+对该酶有很强的抑制作用。
　　该酶对对硝基苯酚丁酸酯(四碳)催化能力远大于对硝基苯酚棕榈酸酯(十六碳),可推测该种酶易水解短链脂肪,具有很强的底物专一性。

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第一章 前言

1. 南极大磷虾的概述

2 脂肪酶概述

3.选题依据及实验设计

第二章 南极大磷虾脂肪酶的分离纯化

1 。实验材料及仪器药品

2 实.验方.法[78-81]

3 实验结果与分析

4 讨论及小结

第三章 南极大磷虾脂肪酶的酶学性质研究

1.实验材料

2.实验仪器

3.实验药品

4.实验方法[95,96]

5.实验结果及分析

6. 讨论及小结

总结

参考文献

致谢

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