丙二醛氧化修饰对虾类原肌球蛋白过敏性质的影响

摘要

虾类因营养丰富，味道鲜美而深受人们喜爱，但虾类又属于八大类主要致敏的食物之一，约有2％的成年人对甲壳类动物过敏。作为虾类主要过敏原，原肌球蛋白的过敏原性在加工贮藏中的变化已经有很多报道，但研究结果差异较大。现有研究表明食品在加工贮藏过程中会发生一系列的化学反应，其中氧化反应是最广泛的一种。特别是对虾类等不饱和脂肪酸含量高的食品，其在贮藏过程中容易发生氧化并产生具有氧化能力的活性小分子物质，如丙二醛等。这些小分子物质的存在可能是导致过敏原性质变化规律差异大的原因之一。因此，本论文以虾类原肌球蛋白为研究对象，以常见的脂肪氧化产物丙二醛为切入点，从蛋白质，效应细胞和体外模拟消化实验等三个层面系统研究丙二醛对原肌球蛋白氧化修饰后，其过敏原性及结构性质的变化，为加工与储藏过程中过敏原性的变化提供理论依据，同时也为开发低过敏性食品提供新的研究思路。主要研究结果如下:
　　1.探讨丙二醛氧化对原肌球蛋白过敏性质及结构的相关性
　　随着丙二醛浓度的增大，原肌球蛋白产生二聚体或更大分子量的聚集体。且这些聚集体能被IgG/IgE识别产生阳性免疫条带，同时ELISA结果表明氧化使过敏原的免疫活性分别下降了56.31％，63.40％，61.92％和50.79％。远紫外CD光谱数据显示，过敏原由紧密结构转化为无规卷曲的松散结构。表面疏水性与对照组相比升高了93倍。同时蛋白质羰基含量增加了14倍，游离氨基和有效赖氨酸含量分别下降了14％和46.77％。综合以上数据，阐明丙二醛使原肌球蛋白交联，免疫活性减弱是由于氧化过程使蛋白的空间构象发生变化，进而消减原肌球蛋白的过敏性质。
　　2.探讨丙二醛氧化对原肌球蛋白潜在致敏性的影响
　　原肌球蛋白激发RBL-2H3细胞释放β-氨基己糖苷酶，组胺，类胰蛋白酶，半胱氨酰白三烯和前列腺素D2的能力显著下降。除患者血清P1对IL-4影响不显著外，其他患者血清均显示释放的IL-4和IL-13含量有显著的下降。综合以上数据，阐明丙二醛通过影响RBL-2H3细胞脱颗粒反应，显著性抑制原肌球蛋白释放活性介质和细胞因子的能力，降低原肌球蛋白的免疫活性。本研究表明，丙二醛在改变原肌球蛋白结构的同时，也能够在细胞水平上改变原肌球蛋白的潜在致敏能力。
　　3.探讨丙二醛氧化对原肌球蛋白体外消化稳定性的影响
　　丙二醛氧化使原肌球蛋白相对耐胃酶消化，表明随着氧化程度的加剧，疏水性增加使聚集体的空间结构发生变化，相应的结构被包裹入蛋白内部，所以免疫活性几乎无明显变化，也可能是酸性的胃蛋白酶环境使氧化后的原肌球蛋白样品趋向稳定，从而抑制胃酶消化速率;但同时原肌球蛋白极易被胰蛋白酶消化，随着蛋白去折叠，更多的消化位点被暴露，蛋白被酶解后，聚集体的构象也随之改变，免疫活性有一定程度的降低。研究表明，丙二醛在改变原肌球蛋白结构的基础上，对其消化稳定性也有较大影响。
　　本课题通过食品加工过程中脂质氧化产生的丙二醛对虾类主要过敏原-原肌球蛋白进行氧化修饰，对其构象及相应的过敏性质进行了深入探讨，初步阐明了氧化对过敏原的影响，为探究食品加工与储藏过程中过敏原性的变化提供了理论依据。

目录

声明

摘要

0 前言

0．1 食物过敏

0．2 水产品过敏

0．2．1 水产品过敏原

0．2．2 虾类过敏原

0．3 食物过敏的研究进展

0．3．1 食物过敏的免疫学机理

0．3．2 食物潜在过敏性的诊断

0．3．3 食物过敏的防治

0．4 食物加工脱敏技术

0．4．1 低过敏活性的技术手段

0．4．2 食品蛋白质氧化

0．5 研究内容

0．6 技术路线

1 MDA氧化修饰对虾类TM过敏性质的影响

1．1 引言

1．2 实验材料和仪器

1．2．1 材料与试剂

1．2．2 实验仪器

1．2．3 溶液配制

1．3 实验方法

1．3．1 TM的提取与纯化

1．3．2 MDA氧化TM样品的制备

1．3．3 SDS-PAGE分析氧化后的TM蛋白组分

1．3．4 免疫印迹法检测氧化后TM与IgG／IgE的结合能力

1．3．5 间接ELISA检测氧化后TM的过敏原活性

1．3．6 二级结构的测定

1．3．7 疏水性的测定

1．3．8 羰基含量的测定

1．3．9 游离氨基含量的测定

1．3．10 有效赖氨酸含量的测定

1．3．11 数据处理

1．4 实验结果与讨论

1．4．1 MDA氧化对TM蛋白组分的影响

1．4．2 MDA氧化对TM IgG／IgE的结合能力的影响

1．4．3 MDA氧化对TM IgG／IgE的免疫活性的影响

1．4．4 MDA氧化对TM二级结构的影响

1．4．5 MDA氧化对TM三级结构的影响

1．4．6 MDA氧化对TM羰基含量的影响

1．4．7 MDA氧化对TM游离氨基和有效赖氨酸含量的影响

1．5 结论

2 MDA氧化修饰对虾类TM潜在致敏性的影响

2．1 引言

2．2 实验材料和仪器

2．2．1 材料与试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 TM的提取与纯化

2．3．2 MDA氧化TM样品的制备

2．3．3 细胞传代与冻存

2．3．4 细胞致敏与激发

2．3．5 细胞活性介质释放的测定

2．3．6 细胞因子释放的测定

2．3．7 数据处理

2．4 结果与讨论

2．4．1 最适TM激发浓度

2．4．2 活性介质的测定

2．4．3 细胞因子的测定

2．5 结论

3 MDA氧化修饰对虾类TM消化稳定性的影响

3．1 引言

3．2 实验材料和仪器

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 溶液配制

3．3 实验方法

3．3．1 TM的提取与纯化

3．3．2 MDA氧化TM样品的制备

3．3．3 SDS-PAGE分析氧化后的TM在模拟胃液中的组分

3．3．4 点印记分析氧化后的TM在模拟胃液中免疫活性的变化

3．3．5 SDS-PAGE分析氧化后的TM在模拟肠液中的组分

3．3．6 点印记分析氧化后的TM在模拟肠液中免疫活性的变化

3．4 结果与讨论

3．4．1 模拟胃液消化对MDA氧化后的对虾TM蛋白组分的影响

3．4．2 模拟胃液消化对MDA氧化后的对虾TM免疫活性的影响

3．4．3 模拟肠液消化对MDA氧化后的对虾TM蛋白组分的影响

3．4．4 模拟肠液消化对MDA氧化后的对虾TM免疫活性的影响

3．5 结论

4 结论与创新性

参考文献

致谢

个人简历

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