丙酮酸羧化酶在海洋解脂耶罗威亚酵母菌合成柠檬酸中的作用

摘要

柠檬酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药与工业领域。目前柠檬酸主要是通过生物发酵的方式获得，其中黑曲霉是工业发酵的主要菌株。然而，黑曲霉发酵产生的废物易污染环境，并且发酵控制技术要求高，对菌株的遗传改造难度也大。在柠檬酸的发酵生产中，解脂耶罗威亚酵母菌能够克服黑曲霉生产中的不足，已经成为近年来研究的热点，作为柠檬酸工业生产菌株也逐渐被人们所认同。
　　在其他人的研究中发现，丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)在有机酸合成方面有着很大的作用。该酶催化丙酮酸形成草酰乙酸，在酵母油脂合成与琥珀酸、α-酮戊二酸以及苹果酸等有机酸积累方面有着重要作用。柠檬酸是草酰乙酸与乙酰CoA通过缩合作用形成的，因此我们认为丙酮酸羧化酶在柠檬酸合成中也起着某些重要作用。为了进一步研究丙酮酸羧化酶在柠檬酸合成调控中的作用，本论文分别克隆了季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Pcla22菌株和海洋霉菌产红青霉（Penicillium rubens）I067菌株的丙酮酸羧化酶基因，并将这些基因在解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）SWJ-1b菌株中进行了表达。
　　pINA1312质粒是适用于在解脂耶罗威亚酵母（Y.lipolytica）中高效表达外源基因的质粒。但在实际应用中，该质粒由于多克隆位点区域可用的酶切位点过少，在表达外源基因的过程中受到了很大的限制。本研究采用引物人工退火与酶切连接的方法，成功构建pINA1312-GY质粒，在pINA1312质粒上增加3个新的酶切位点，为外源基因在Y.lipolytica中表达构建了方便有效的工具。
　　季也蒙毕赤酵母（P.guilliermondii）是一株已全基因组测序的菌株，具有遗传背景清楚和高产有机酸的优点。将一株分离自海洋的季也蒙毕赤酵母Pcla22菌株的丙酮酸羧化酶基因(PYC)在解脂耶罗威亚酵母SWJ-1b菌株中进行了表达。研究发现，转化子PG86的丙酮酸羧化酶酶活和柠檬酸产量都明显高于原始菌株SWJ-1b。在补料发酵条件下，转化子PG86的发酵液柠檬酸浓度为101.0±1.3g/l，糖转化为柠檬酸的得率为0.89 g/g。HPLC检测表明发酵产物主要为柠檬酸。这表明丙酮酸羧化酶基因(PYC)得到了超表达，且该酶在柠檬酸合成调控中具有重要作用，超表达丙酮酸羧化酶可以促进柠檬酸的累积。
　　海洋霉菌产红青霉（P.rubens）是一株高产有机酸的菌株，目前对它的研究还很少。本实验采用简并引物和基因组步移的方法，克隆了产红青霉（P.rubens）I067菌株的丙酮酸羧化酶基因及其上下游调控区基因。该菌丙酮酸羧化酶基因（登录号:KM397349.1）ORF框共3534 bp，编码1177个氮基酸，预测的蛋白质分子量为127.531 kDa，等电点pI6.20。启动子位于基因上游-1200bp位置，包含一个TATAA框、多个CAAT框和5'-SYGGRG-3'序列。该酶无信号肽，为同源四聚体结构(α4)，每一单体包含四个功能区域。
　　为了进一步提高柠檬酸产量，将1607菌株的丙酮酸羧化酶基因(RPYC)在解脂耶罗威亚酵母SWJ-1b菌株中进行表达。研究发现，转化子PR32的丙酮酸羧化酶酶活可达0.53 U/mg，高于相同条件下SWJ-1b菌株和PG86菌株的酶活（分别为0.07 U/mg和0.38 U/mg）。测定了补料发酵条件下转化子PR32菌株的产柠檬酸能力，发现其发酵液中柠檬酸浓度为111.1±1.3g/l，糖转化为柠檬酸的得率为0.93 g/g。进一步表明，提高丙酮酸羧化酶酶活力，可以将更多的CO2固定到糖代谢中并生成更多的草酰乙酸，进而草酰乙酸和乙酰CoA合成了更高水平的柠檬酸。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 柠檬酸

1．1 柠檬酸的性质及主要应用

1．2 柠檬酸的工业生产

1．3 柠檬酸生产菌株

1．4 柠檬酸的生物合成途径

2 丙酮酸羧化酶

2．1 丙酮酸羧化酶的性质及功能

2．2 丙酮酸羧化酶的结构特征

2．3 丙酮酸羧化酶的作用机制

2．4 丙酮酸羧化酶在有机酸代谢中的作用

3 论文立项依据和研究内容

第二章 pINA1312质粒的改造

1 前言

2 材料与方法

2．1 质粒和菌株

2．2 培养基与试剂

2．3 实验方法

3 结果与讨论

4 本章小结

第三章 P．guilliermondii丙酮酸羧化酶基因在Y．lipolitica表达和柠檬酸的小规模生产

1 前言

2 材料与方法

2．1 质粒和菌株

2．2 培养基与试剂

2．3 实验方法

3 结果与讨论

3．1 基因组DNA的提取

3．2 P．guilliermondii丙酮酸羧化酶基因表达质粒的构建

3．3 转化Y．lipolytica酵母细胞

3．4 转化子筛选验证

3．5 丙酮酸羧化酶酶活及基因表达水平

3．6 葡萄糖浓度的优化

3．7 补料分批发酵培养

3．8 发酵产物检测

4 本章小结

第四章 P．rubens丙酮酸羧化酶的基因克隆及生物信息学分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 质粒和菌株

2．2 培养基与试剂

2．3 实验方法

3 结果与讨论

3．1 基因组DNA的提取

3．2 简并引物PCR扩增

3．3 基因组步移技术获得丙酮酸羧化酶基因全长

3．4 丙酮酸羧化酶基因蛋白序列生物信息学分析

4 本章小结

第五章 P．rubens丙酮酸羧化酶基因在Y．lipolitica中表达和柠檬酸的小规模生产

1 前言

2 材料与方法

2．1 质粒和菌株

2．2 培养基与试剂

2．3 实验方法

3 结果与讨论

3．1 P．rubens丙酮酸羧化酶基因表达质粒的构建

3．2 转化Y．lipolytica酵母细胞

3．3 转化子筛选验证

3．4 丙酮酸羧化酶比酶活及基因表达水平

3．5 葡萄糖浓度的优化

3．6 补料分批发酵培养

4 本章小结

论文总结与创新点

参考文献

附录

致谢

个人简历及发表的学术论文