红鳍东方鲀刺激隐核虫病中草药防治及其血清免疫球蛋白IgM的纯化和特性研究

摘要

近些年来，红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）作为重要的海水养殖经济鱼类，由于其肉质细嫩、味道鲜美、蛋白质含量高以及营养含量丰富等优点，而素有“鱼类之王”的美称。地理位置多分布于黄海、渤海和日本海域。是一种可以进行养殖的鲀科鱼类中的优良品种。然而随着养殖规模的不断扩大，各种疾病所造成的伤害也就越来越大，从而导致大量化学的药物的滥用，其后果是药物残留、病虫害的耐药性和大片海域药物的扩散直接影响食品安全和环境公共卫生安全。因此迫切需要研制出对环境无污染、不具有耐药性的药物。同时对红鳍东方鲀免疫机制的研究，期望在疾病爆发时，也可以通过免疫机制进行防御。
　　刺激隐核虫病(Cryptocaryon irritans Brown1951)作为养殖红鳍东方鲀的主要寄生虫病，给水产养殖业造成巨大的经济损失，关于防治刺激隐核虫病的方法主要是通过化学药物进行防治，但是给鱼体本身和环境都造成很大的副作用。本实验主要是通过对刺激隐核虫的观察和从中草药方面进行筛选，从而得到最有效杀灭刺激隐核虫的中草药。同时也了解到当红鳍东方鲀感染刺激隐核虫时，其免疫系统发挥着重要作用，因此对免疫反应中最直接起到作用的血清IgM进行纯化分析，制备多抗，为进一步开展红鳍东方鲀免疫学方面的研究打下良好的基础。本论文是在国家科技支撑计划的资助下完成的。主要从刺激隐核虫生活史的观察以及比较分析了槟榔、苦参、大黄、贯众、黄芩、野菊花等15种中草药对刺激隐核虫滋养体和幼虫的离体杀灭效果，并探讨了刺激隐核虫包囊破裂产生幼虫的最适温度和盐度条件。同时对红鳍东方鲀血清免疫球蛋白IgM进行了分离纯化，并对其特性进行初步研究与分析，用纯化的红鳍东方鲀IgM免疫BALB/c小鼠并制备抗血清。用饱和硫酸铵沉淀法分级纯化红鳍东方鲀血清免疫球蛋白IgM，所得粗提产物用DEAE Fast Flow离子交换层析、Protein A亲和层析和IgMPurification亲和层析进一步纯化比较，蛋白浓度测定、间接ELISA效价测定、SDS-PAGE和Western-blotting分析。具体研究结果如下:
　　(1)刺激隐核虫滋养体的收集、包囊和幼虫的培养以及形态学观察。滋养体呈圆形或梨形，在所寄生组织处缓慢旋转，部分滋养体可观察到U形排列的大核，离体后的滋养体逐渐变圆形成包囊。分别观察并测量了约20个滋养体、包囊和幼虫的虫体大小，发现滋养体与包囊大小相似，约为200～500μm，幼虫大小为30～50μm。
　　(2)杀灭刺激隐核虫中草药的筛选及包囊破裂的最适温度和盐度的研究。中草药药物浓度为4.55g/L时，槟榔对滋养体和幼虫有杀灭效果，大黄和野菊花仅对幼虫有杀灭效果;药物浓度9.09g/L时，苦参、贯众对滋养体和幼虫具有杀灭效果。药物浓度18.18g/L时，黄芩、川楝子、枳壳、对滋养体和幼虫都具有杀灭效果，野菊花对滋养体具有杀灭效果;在45.45g/L和90.91g/L较高药物浓度时，黄芪、鱼腥草、板蓝根、白头翁、金银花、熟地黄对幼虫和滋养体具有杀灭效果。实验结果表明槟榔、苦参、大黄、贯众、黄芩、枳壳、川楝子、野菊花杀虫效果显著;黄芪、鱼腥草、板蓝根、白头翁、金银花、熟地黄、黄连的杀虫效果不显著。不同培养温度和盐度对刺激隐核虫包囊破裂产出幼虫所需时间比较结果显示，包囊破裂产出幼虫的最适温度为26℃、最适盐度为20～30‰。
　　(3)红鳍东方鲀血清IgM的纯化和特性分析。采用硫酸铵沉淀法分级提取的红鳍东方鲀IgM最适合的硫酸铵饱和度为50％;最佳纯化IgM方法为IgMPurification亲和层析;SDS-PAGE电泳显示红鳍东方鲀IgM重链为68.4kD，轻链为27.9kD。
　　(4)红鳍东方鲀血清IgM鼠多抗制备的研究及其与许氏平魷、花鲈等海水鱼类血清IgM的交叉反应。IgM免疫BALB/c小鼠，获得鼠抗红鳍东方鲀IgM血清，抗血清效价为1∶128000。鲀化的红鳍东方鲀IgM重链与特异性抗血清具有较好的反应，而轻链与抗血清反应不明显。鼠抗红鳍东方鲀血清IgM的多克隆抗体除了与红鳍东方鲀反应外，与许氏平魷、花鲈、真鲷、大菱鲆血清IgM的反应也呈现为阳性。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 刺激隐核虫的流行病学及防治措施

1．1．1 刺激隐核虫病原学

1．1．2 刺激隐核虫生活史

1．1．3 刺激隐核虫的宿主及发病特征

1．1．4 刺激隐核虫的危害及防治

1．2 鱼类免疫系统的研究进展

1．2．1 鱼类的免疫器官和组织

1．2．2 鱼类的非特异性免疫应答

1．2．3 鱼类的特异性免疫应答

1．3 本实验研究的目的及意义

2 刺激隐核虫病的防治研究

2．1 材料与方法

2．1．1 刺激隐核虫滋养体的收集、包囊和幼虫的培养以及形态学观察

2．1．2 实验用中草药

2．1．3 中草药药液制备

2．1．4 中草药杀灭滋养体、幼虫

2．1．5 温度和盐度对包囊破裂、幼虫脱包产出的影响

2．2 结果

2．2．1 症状及虫体形态

2．2．2 中草药对滋养体杀灭效果

2．2．3 中草药对幼虫杀灭效果

2．2．4 温度、盐度对包囊破裂幼虫产出的影响

2．3 讨论

3 红鳍东方鲀免疫球蛋白的纯化及特性分析

3．1 实验材料与试剂

3．1．1 实验用鱼

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 红鳍东方鲀血清制备

3．2．2 饱和硫酸铵粗提IgM

3．2．3 层析

3．2．4 浓缩

3．2．5 纯度分析

3．2．6 分子量测定

3．3 实验结果

3．3．1 饱和硫酸铵粗提纯化IgM的结果

3．3．2 SDS-PAGE电泳分析的结果

3．3．3 红鳍东方鲀血清蛋白浓度

3．3．4 红鳍东方鲀与其他4种海水鱼的igM的比较

3．4 讨论

4 红鳍东方鲀免疫球蛋白IgM多克隆抗体的制备及其与其他4种海水鱼类的免疫交叉反应

4．1 实验材料与试剂

4．1．1 实验动物

4．1．2 主要试剂

4．2 实验方法

4．2．1 鼠抗血清IgM的制备

4．2．2 鼠抗红鳍东方鲀血清IgM效价的测定

4．2．3 鼠抗血清IgM的Western Blot检测

4．2．4 鼠抗血清IgM交叉反应检测

4．3 实验结果

4．3．1 鼠抗红鳍东方鲀IgM血清效价

4．3．2 鼠抗IgM血清的Western Blot检测

4．3．3 鼠抗IgM血清交叉反应检测

4．4 讨论

总结

参考文献

致谢

个人简历

硕士期间发表文章