副溶血弧菌噬菌体VPp1内溶素基因预测表达及其抑菌活性初步研究

摘要

副溶血弧菌是一种革兰氏阴性菌，可导致人畜共患病，广泛的存在于海洋环境及各种海产品中，包括海水沉积物、鱼、虾、贝类等。副溶血弧菌被认为是海水养殖动物的条件致病菌，并且容易引发人类大规模食物中毒，为了防控副溶血弧菌的危害，抗生素的大量使用导致弧菌耐药性增强，新型抗菌素的需求已经迫在眉睫。噬菌体及其编码的内溶素是细菌的自然天敌，可以专一、快速、高效的裂解细菌，内溶素又被称为21世纪最有前景的酶类抗生素之一。
　　本研究以副溶血弧菌噬菌体为研究对象，通过对实验室保存的多株副溶血弧菌噬菌体进行初步筛选，从中筛选出一株优势噬菌体VPp1，通过对噬菌体VPp1功能基因组学分析，从生物信息学的角度诠释噬菌体VPp1对副溶血弧菌的裂解机制，并推定出编码内溶素基因，利用基因工程技术对内溶素基因进行克隆和表达，利用物理化学方法对重组内溶素LysVPp1生物学活性进行验证。
　　1.对14株副溶血弧菌噬菌体进行初步的筛选，通过增殖获得高效价噬菌体、限制性内切酶HindⅢ进行酶切，并对裂解谱进行了测定。研究中发现噬菌体VPp1增殖后可以获得较高的效价、酶切鉴定为一株新型噬菌体、裂解3种副溶血弧菌、裂解液最澄清，并且前期研究结果表明噬菌体VPp1在检测牡蛎中副溶血弧菌和控制牡蛎中副溶血弧菌方面有较好的表现，最终选取副溶血弧菌噬菌体VPp1进行后续研究。本实验室已完成副溶血弧菌噬菌体VPp1的全基因组测序及初步基因组信息注释，并已在GenBank上登录(No.KJ936628)。
　　2.通过对副溶血弧菌噬菌体VPp1全基因组分析，利用相似性比对数据库BLAST和序列模体数据库，初步推定该基因组的ORF31编码内溶素，预测该开放式阅读框编码一种糖苷水解酶。预测内溶素等电点为4.58，质量分数28.2kDa，不含信号肽、跨膜区域，含有两个疏水域、一个结构域。蛋白质结构分析显示其二级结构主要是无规则卷曲，三级结构与溶菌酶结构具有相似性。从生物信息学角度推定噬菌体VPp1内溶素的裂解机制可能是联合孔蛋白协同作用裂解细菌肽聚糖。
　　3.选取pET克隆表达系统的pET-28a表达载体，以Rosetta(DE3)为宿主菌进行内溶素的重组表达，在最佳的诱导时间4h、温度37℃和IPTG浓度0.1mmol/L条件下，诱导表达生成可溶性重组内溶素LysVPp1;SDS-PAGE检测重组内溶素分子质量大小约为40kDa;通过非变性Ni2+亲和层析柱纯化，10kDa截留超滤离心管除盐和浓缩，最终获得蛋白浓度为1mg/mL的重组内溶素LysVPp1，于-20℃保存。
　　4.对重组内溶素LysVPp1的酶学性质进行探究，测得其对细菌肽聚糖、死细菌和活菌均有较强裂解能力;LysVPp1作用条件较温和，pH5-8时可保持较好的活性，55℃条件下30min仍能保持60％以上的活性，-20℃条件下保存半年仍有80％以上的活性。此外，低浓度Zn2+和Ca2+可以明显提高LysVPp1活性。LysVPp1对15种副溶血弧菌中的9种显示出裂解性，裂解谱比噬菌体VPp1裂解谱更宽。LysVPp1的特性表明其具有成为新型酶类抗生素的潜力。
　　综上所述，本研究首先通过噬菌体筛选得到优势噬菌体VPp1，序列与结构分析提示副溶血弧菌噬菌体VPp1内溶素可能是一种糖苷水解酶;对VPp1内溶素基因进行克隆和诱导表达，利用非变性的Ni-NTA柱亲和层析和超滤浓缩，获得纯化的重组内溶素LysVPp1;获得的LysVPp1经体外活性检测证实，对副溶血弧菌细胞壁肽聚糖具有降解活性，并且对EDTA处理后死菌和活菌均有裂解活性。本研究丰富了噬菌体基因组注释信息，填补了副溶血弧菌噬菌体内溶素研究的空白，也为利用副溶血弧菌噬菌体内溶素进行控制和预防致病性副溶血弧菌提供理论基础和技术支持。

目录

声明

摘要

0 前言

0．1 副溶血弧菌简介

0．1．1 副溶血弧菌生理特性

0．1．2 副溶血弧菌致病机理

0．1．3 副溶血弧菌分布及其危害

0．1．4 弧菌危害的防控措施

0．2 噬菌体及其基因组学

0．2．1 噬菌体的生理特性

0．2．2 噬菌体的裂解机制

0．2．3 噬菌体基因组学

0．3 噬菌体内溶素研究

0．3．1 噬菌体编码内溶素的分类及结构

0．3．2 噬菌体内溶素的制备方法

0．3．3 噬菌体内溶素的应用现状

0．4 研究目的和意义

0．5 技术路线

1 副溶血弧菌噬菌体初步筛选

1．1 引言

1．2 材料

1．2．1 菌株

1．2．2 培养基

1．2．3 试剂

1．2．4 主要仪器

1．3 方法

1．3．1 噬菌体的增殖

1．3．2 噬菌体效价测定

1．3．3 噬菌体基因组提取

1．3．4 噬菌体核酸的酶切鉴定

1．3．5 噬菌体裂解谱的测定

1．4 实验结果

1．4．1 噬菌体增殖及效价测定

1．4．2 噬菌体核酸提取

1．4．3 噬菌体核酸酶切鉴定

1．4．4 噬菌体的裂解谱

1．5 讨论

1．6 小结

2 副溶血弧菌噬菌体VPp1内溶素基因预测与结构分析

2．1 引言

2．2 方法

2．2．1 副溶血弧菌噬菌体VPp1全基因组推定基因及其编码产物同源性分析

2．2．2 构建系统进化树

2．2．3 蛋白质功能预测

2．2．4 推定内溶素理化特征分析

2．2．5 内溶素编码氨基酸的信号肽序列预测

2．2．6 内溶素编码氨基酸的跨膜结构预测

2．2．7 内溶素编码氨基酸的结构域预测

2．2．8 内溶素编码氨基酸的二级结构预测

2．2．9 内溶素编码氨基酸序列的三级结构预测

2．3 实验结果

2．3．1 副溶血弧菌噬菌体VPp1全基因组推定基因及其编码产物同源性分析

2．3．2 构建系统进化树

2．3．3 蛋白质功能预测

2．3．4 推定内溶素理化特征分析

2．3．5 内溶素编码氨基酸的信号肽序列预测

2．3．6 内溶素编码氨基酸的跨膜结构预测

2．3．7 内溶素编码氨基酸的结构域预测

2．3．8 内溶素编码氨基酸的二级结构预测

2．3．9 内溶素编码氨基酸序列的三级结构预测

2．4 讨论

2．5 小结

3 副溶血弧菌噬菌体VPp1内溶素LysVPp1基因克隆、表达与纯化

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 质粒和菌株

3．2．2 试剂

3．2．3 试剂配置

3．2．4 主要仪器

3．3 方法

3．3．1 噬菌体内溶素基因的克隆表达

3．3．2 重组内溶素表达条件及表达方式

3．3．3 重组内溶素纯化

3．3．4 考马斯亮蓝G250法测定蛋白浓度

3．4 实验结果

3．4．1 内溶素基因的PCR扩增

3．4．2 阳性重组子的筛选及基因序列

3．4．3 重组大肠杆菌初步诱导表达

3．4．4 重组内溶素表达条件优化及表达形式确定

3．4．5 重组内溶素LysVPp1的纯化及浓度的测定

3．5 讨论

3．6 小结

4 重组内溶素LysVPp1体外抑菌活性鉴定

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 菌株

4．2．2 试剂

4．2．3 主要仪器

4．3 方法

4．3．1 扩散法定性检测重组内溶素LysVPp1酶活

4．3．2 浊度法定量检测重组内溶素LysVPp1酶活

4．3．3 去污剂对重组内溶素LysVPp1裂解作用的影响

4．3．4 重组内溶素LysVPp1最佳作用条件

4．3．5 重组内溶素LysVPp1裂解谱的测定

4．4 结果

4．4．1 扩散法定性检测重组内溶素LysVPp1酶活

4．4．2 浊度法定量检测重组内溶素LysVPp1酶活

4．4．3 去污剂对重组内溶素LysVPp1裂解作用的影响

4．4．4 重组内溶素LysVPp1最佳作用条件

4．4．5 重组内溶素LysVPp1裂解谱的测定

4．5 讨论

4．6 小结

5 论文结论

6 论文创新点

7 下一步展望

参考文献

附录

致谢

个人简历

发表的学术论文