青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)多胺氧化酶基因Bjpao2的鉴定、表达和功能研究

摘要

多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）是FAD分子作为辅酶能够催化多胺和乙酰多胺氧化的一种单体可溶性蛋白。目前，多种动物以及植物和细菌中的多胺氧化酶都已经被鉴定出来。通常情况下，植物中的多胺氧化酶能够氧化精胺、亚精胺和它们的乙酰化产物N1-乙酰精胺和N1-乙酰亚精胺;然而酵母中的多胺化精胺、N1-乙酰精胺和N1-乙酰亚精胺，但是不能氧化亚精胺;在脊椎动物中有两种不同的多胺氧化酶，分别是精胺氧化酶(SMO)和乙酰多胺氧化酶（APAO）能够分别氧化精胺和N1-乙酰精胺/N1-乙酰亚精胺;而且在处于进化关键位置的青岛文昌鱼中已经鉴定出一条多胺氧化酶基因为Bjpao1，能够氧化亚精胺和精胺。但是，我们对多胺氧化酶的生化和结构特征了解非常局限，同时多胺氧化酶的进化过程也是令人迷惑不解的。
　　本研究成功克隆得到了青岛文昌鱼中的另一条多胺氧化酶基因Bjpao2，Bjpao2全长为2050bp，ORF长度为1473bp，能够编码491个氨基酸的蛋白质(Bj PAO2)，分子量约为55.3 kDa，BjPAO2在N端含有一个FAD结合结构域，21-483之间是PAO功能域，并且没有信号肽的存在。序列分析发现Bjpao2与Bjpao1有37.7％的一致性，与其他物种的多胺氧化酶有31.0％到40.9％的一致性，而且具有已知物种SMO、APAO和PAO基因的保守活性位点，Trp67、His69、Lys315、Tyr424和Thr467。同时Bjpao2的表达呈现组织特异性。在肝盲囊和后肠中的表达量最高。
　　其次，我们研究了Bjpao2的生理功能，我们将Bjpao2成功进行了蛋白质的体外重组表达和纯化得到了体外重组蛋白rBjPAO2，并对其进行了酶活性的测定，发现rBjPAO2能够氧化亚精胺和N1-乙酰精胺，但是不能氧化精胺。为了研究BjPAO2结构和功能的关系，我们对BjPAO2中的保守活性位点进行了定点突变，并对突变体蛋白进行了表达、纯化和酶活性的测定。发现突变体蛋白的Km值都有不同程度的增加，Vmax值则有不同程度的降低，说明rBjPAO2中的H69，K315和T467在一定程度上参与了酶与底物的结合以及酶活性位点的组成，表明这三个氨基酸对rBjPAO2的酶活性是必不可少的。基于以上的实验结果和其他人的实验结果，我们拟建了一个脊椎动物SMO和APAO趋异进化和功能专化的简单模型。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 文昌鱼

1．1 文昌鱼简介

1．2 文昌鱼与基因倍增学说

2 多胺(Polyamine)和多胺氧化酶(Polyamine oxidase)

2．1 多胺和多胺的代谢

2．2 多胺氧化酶的分类

2．3 多胺氧化酶的功能

2．4 多胺氧化酶的进化

3 研究目的技术路线

3．1 研究目的

3．2 技术路线

第二章 青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)多胺氧化酶基因Bjpao2的鉴定、表达和功能研究

1、前言

2 实验材料与方法

2．1 文昌鱼的采集和RNA的提取

2．2 文昌鱼Bjpao2基因全长的克隆

2．3 Bjpao2基因序列分析

2．4 实时荧光定量PCR检测组织分布

2．5 BjPAO2重组蛋白质的表达

2．6 点突变实验

2．7 Wrestern技术

2．8 酶活性的测定

3 实验结果

3．1 文昌鱼Bjpao2基因全长的克隆

3．2 文昌鱼Bjpao2基因的生物信息学分析

3．3 文昌鱼Bjpao2基因RNA水平在不同组织中的表达

3．4 文昌鱼BjPAO2的体外重组表达

3．5 文昌鱼rBjPAO2及突变体酶活性的测定

4 讨论

参考文献

致谢

个人简历

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