马钱子—苏木与马钱子—白术配伍减毒增效及治疗痹证机理的研究

摘要

目的:在中医药理论指导下,以临床应用为依据,对古今医家应用马钱子配伍减毒增效的相关文献进行系统梳理,通过对马钱子-苏木、马钱子-白术(以下简称马苏、马术)不同配比毒性、镇痛、抗炎作用的实验研究,观察配伍后的减毒增效作用,寻求最佳配比,并分别从抗自由基损伤、细胞因子和细胞凋亡三方面,探求其镇痛、抗炎免疫和细胞凋亡的机理;从气味配伍理论方面,阐释马苏、马术配伍后减毒增效的理论意义及治疗痹证的配伍意义,为临床应用马钱子治疗RA提供科学依据。方法:1.采用高效液相色谱法(HPLC),测定马苏、马术不同配比煎剂在配伍后马钱子碱和士的宁含量的变化;通过急性毒性实验,观察小鼠死亡状态、记录死亡数量,采用Bliss法计算半数致死量(LD50),分析不同配比毒性强弱的变化,并寻求减毒最佳配比。2.通过小鼠热板法和扭体法,分别测定给药后小鼠舔足潜伏期和15min内扭体总数,并计算不同配比煎剂对扭体反应的抑制率,观察对小鼠镇痛作用的影响,寻求镇痛最佳配比。3.建立佐剂关节炎大鼠模型,用千分尺测定大鼠足跖肿胀程度;计算免疫器官系数;测定佐剂关节炎(AA)大鼠血清中NO、SOD、MDA含量。采用酶联免疫吸附法(Elisa)测定AA大鼠血清中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、CRP、CIC、滑膜中PGE2、Cor的含量变化;采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR),观察滑膜组织IL-1β、IL-10、TNF-α mRNA的表达,探讨不同配比镇痛和免疫的机理,寻求最佳配比;采用Elisa法测定AA大鼠滑膜中Fas、Bcl-2的含量,通过免疫组化法(IHC)观察滑膜中Fas的表达情况,初步观察不同配比抗细胞凋亡的机理。4.采用HE染色,观察大鼠肝、肾、脑组织病理变化,对比分析不同配比对各组织的长期毒性影响;观察滑膜组织病理变化,分析给药后抗炎疗效。结果:1.通过HPLC测定,与马钱子单煎剂比较,马苏1:2、1:4、1:6煎剂马钱子碱含量分别降低68.8％、76.8%、99.3%,士的宁含量分别降低56.8%、66.9%、93.6%;马术1:2、1:4、1:6煎剂中马钱子碱分别升高17.6%,降低23.5%、29.0%,士的宁含量分别升高60.7%、降低8.51%、16.6%。2.马苏、马术对小鼠急性毒性的影响通过计算马钱子单煎剂、马苏1:2、1:4、1:6和马术1:2、1:4、1:6煎剂组的LD50分别为605.92、827.21、1084.7、1479.4、401.64、664.1、953.79mg/kg。3.马苏、马术对小鼠镇痛作用的影响热板法:马苏1:4、1:6和马术1:6煎剂组在给药后能提高小鼠痛阈值,延长疼痛反应时间(P＜0.01或P＜0.05),其中以马苏、马术1:6煎剂组效果较好。扭体法:马术1:6煎剂组对小鼠扭体次数的抑制作用明显强于马钱子单煎剂组(P＜0.05),扭体抑制率为26.75%,效果较佳,其余各组无明显变化。4.马苏、马术对AA大鼠抗炎作用的影响原发性足跖肿胀:在治疗过程中马钱子单煎剂、马苏1:4、1:6和马术1:6煎剂组能明显减轻大鼠足跖肿胀程度,抗炎效果较为明显(P＜0.01或P＜0.05)。继发性足跖肿胀:各配伍组给药后足跖肿胀明显减轻,马苏1:4、1:6和马术1:6煎剂组抗炎效果较为突出(P＜0.01或P＜0.05),较佳配比为马苏1:6、马术1:6。5.马苏、马术对AA大鼠免疫器官系数的影响马钱子单煎剂组、马苏1:4、1:6和马术1:2、1:4、1:6煎剂组可使胸腺系数减小(P＜0.01或P＜0.05)。马钱子单煎剂组、马苏1:2、1:4和马术1:6煎剂组大鼠脾系数明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。6.马苏、马术对AA大鼠血清NO、SOD、MDA的影响马苏1:6煎剂组能降低大鼠血清中NO含量(P＜0.05);马钱子单煎剂组、马苏1:2、1:4、1:6和马术1:2、1:4、1:6煎剂组可提高SOD的含量(P＜0.05或P＜0.01);马苏1:4、1:6和马术1:2、1:4、1:6煎剂组能明显降低MDA含量(P＜0.01)。7.马苏、马术对AA大鼠细胞因子的影响给药后,马苏1:2煎剂组中IL-1β、CRP的含量有所降低(P＜0.01或P＜0.05),马苏1:4煎剂组中IL-1β、TNF-α、CRP含量降低明显(P＜0.01或P＜0.05),马苏1:6煎剂组中IL-1β、TNF-α、IL-6、CIC、CRP含量降低明显(P＜0.01或P＜0.05);给药后,马术1:2煎剂组中IL-6、IL-10、CRP的含量有所降低(P＜0.01或P＜0.05),马术1:4煎剂组中IL-1β、IL-6、IL-10、CRP、CIC、 Cor含量降低明显;马术1:6煎剂组中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、CRP、CIC、Cor含量降低明显(P＜0.01或P＜0.05)。8.马苏、马术对AA大鼠滑膜组织细胞因子mRNA表达的影响马钱子单煎剂组、马苏1:2、1:4、1:6煎剂组的IL-1β mRNA表达水平明显下调(P＜0.05或P＜0.01)。马苏1:6煎剂组IL-10mRNA表达较模型组明显上调(P＜0.05)。各组对TNF-α mRNA的表达均无明显影响。9.马苏、马术对AA大鼠细胞凋亡因子Fas、Bcl-2的影响马钱子单煎剂组、马苏1:6煎剂组能显著降低大鼠滑膜组织中Fas的含量(P＜0.01);同时,IHC显示马苏1:6煎剂组较模型组Fas的阳性表达减少,定位于胞浆内。马苏1:6煎剂组能明显提高滑膜组织中Bcl-2的含量(P＜0.05)。10.马苏、马术对AA大鼠肝、肾、脑和滑膜组织病理形态学的影响配伍组能显著改善对肝脏炎细胞浸润、纤维组织增生,减少肾脏肾小球萎缩和系膜增生、改善肾小管管腔狭窄和管腔蛋白;改善脑组织皮层水肿和神经元固缩。减轻滑膜组织增厚、炎细胞浸润、纤维组织增生和坏死,以马苏、马术1:6煎剂组效果最明显。结论:马苏、马术配伍后可降低马钱子毒性,增强马钱子镇痛和抗炎作用,适宜的配比具有减毒增效作用。马苏抗炎免疫的机理为降低NO、MDA、IL-1β、IL-1βmRNA和TNF-α,减少IL-6的分泌,使CIC和CRP含量降低,降低促凋亡因子Fas并升高SOD和抑制凋亡因子Bcl-2含量,上调IL-10mRNA的表达;马术抗炎免疫的机理为通过降低MDA、IL-1β和TNF-α,减少IL-6的分泌,降低CIC、CRP和Cor的产生,升高SOD含量。马苏、马术具有多层次、多途径、多靶点的抗炎及免疫调节作用。本研究减毒增效的最佳配比为马苏1:6,马术1:6。

目录

提要

Abstract

引言

理论研究

一、古今对马钱子的认识

（一） 中医学对马钱子的认识

（二） 现代医学对马钱子的研究

二、古今对苏木的认识

（一） 中医学对苏木的认识

（二） 苏木的药理学研究

三、古今对白术的认识

（一） 中医学对白术的认识

（二） 白术的药理学研究

四、古今对 RA 的认识

（一） 中医学对 RA 的认识

（二） 现代医学对 RA 的病因病机的研究

五、马钱子及其复方治疗 RA 的研究进展

六、马苏、马术的古今临床应用研究

七、对有毒中药配伍减毒增效作用的认识

实验研究

一、HPLC 测定马苏、马术配伍前后马钱子碱和士的宁的含量变化

（一） 实验材料

（二） 实验方法

（三） 实验结果

二、马苏、马术对小鼠急性毒性的影响

（一） 实验材料

（二） 实验条件

（三） 实验方法

（四） 实验结果

三、马苏、马术对小鼠镇痛作用的影响

（一） 实验材料

（二） 实验条件

（三） 实验方法

（四） 实验结果

四、马苏、马术对 AA 大鼠抗炎作用的影响

（一） 实验材料

（二） 实验条件

（三） 实验方法

（四） 实验结果

五、马苏、马术对 AA 大鼠细胞因子的影响

（一） 实验材料

（二） 实验方法

（三） 实验结果

六、马苏、马术对 AA 大鼠细胞因子 IL-1β、IL-10、TNF-α mRNA 表达的影响

（一） 实验材料

（二） 实验方法

（三） 实验结果

七、马苏、马术对 AA 大鼠滑膜组织细胞凋亡的影响

（一） 实验材料

（二） 实验方法

（三） 实验结果

讨论

一、马苏、马术配伍后主要毒性成分变化的探讨

二、马苏、马术对小鼠急性毒性影响探讨

三、马苏、马术对小鼠镇痛作用影响的探讨

四、马苏、马术对 AA 大鼠抗炎作用的影响

五、马苏、马术对 AA 大鼠免疫器官作用的影响

六、马苏、马术对 AA 大鼠抗自由基损伤作用的影响

七、马苏、马术对 AA 大鼠免疫机理的探讨

八、马苏、马术对 AA 大鼠肝、肾、脑和滑膜病理形态学的影响

（一） 马苏、马术对 AA 大鼠肝、肾、脑组织病理变化的探讨

（二） 马苏、马术对 AA 大鼠滑膜组织病理变化的探讨

九、马苏、马苏配伍减毒增效的理论探讨

（一） 马钱子中毒反应与肝风内动关系的探讨

（二） 马苏、马术配伍减毒的探讨

（三） 马苏、马术对于痹证配伍增效的探讨

十、马苏、马术减毒增效配比的探讨

十 一、马钱子气味结合配伍减毒增效作用之探讨

结语

参考文献

附录一

附录二

致谢