大肠杆菌胆碱脱氢酶基因在毕氏酵母（pichia pastoris）中的表达

摘要

甜菜碱作为参与生物渗透调节的优良保护剂受到人们的广泛关注,最近甜菜碱的甲基供体功能也得到了临床和生化实验的进一步验证,甜菜碱对肠胃的渗透调节功能、甲基供体功能以及抗球虫病和提高饲料的利用率的特性,使其成为良好的饲料添加剂.该实验采用基因工程的方法,在毕氏酵母(Pichiapastoris)中表达大肠杆菌(Escherichia coli)的CDH酶(choline dehydrogenase),以期获得能够催化甜菜碱合成的基因工程化的益生酵母菌株.该实验以E. coli基因组DNA为模板,利用nested PCR扩增得到CDH的编码基因betA,连接入pUC-T vector,与已报道序列比较发现存在6个碱基序列的差异,编码的氨基酸在3个位点存在差异,但疏水性相差不大.选择能够在毕氏酵母中特异表达的载体pPIC9K,构建了可以在E. coli和毕氏酵母中表达的穿梭质粒,转化E. coli后提取质粒并用sacI酶线性化,750V/4.3ms电击转化毕氏酵母,在MGY(Minimal Glycerol Medium)培养基上筛选得到转betA的酵母菌,PCR鉴定结果显示转化的betA基因整合进入酵母基因组中.转化菌株经甲醇诱导后能够表达CDH并分泌到细胞外.CDH经50％的硫酸铵沉淀后,SDS-PAGE电泳可以检测到表达的CDH;体外用PMS-Cyt.c作为电子受体检测到CDH酶的活性明显高于对照菌株;HPLC也检测到CDH催化的以胆碱为底物合成的甜菜碱.结果表明,转betA的毕氏酵母能够表达CDH,并能将合成的具有活性的CDH分泌到细胞外;体外实验显示有胆碱存在时,CDH可以催化甜菜碱的合成.我们获得了成功转化betA的酵母菌株.

目录

独创声明

综述

正文

一、大肠杆菌胆碱脱氢酶基因(betA)的克隆及序列测定

1.大肠杆菌基因组DNA的提取

2.胆碱脱氢酶基因(betA)的扩增

3.目的片段的序列测定

二、穿梭质粒的构建及酵母菌的转化

1.穿梭质粒pPIC9K+betA的构建及大肠杆菌的转化

2.穿梭质粒的线性化及酵母菌的转化

三、胆碱脱氢酶的活性测定及甜菜碱的含量测定

1.胆碱脱氢酶活性的测定

2.甜菜碱含量的测定

实验结果

讨论

结论

参考文献

图版

附录

致谢