四价Aβ15基因在毕赤氏酵母中的高效表达、表达产物的纯化及其免疫学特性研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性的记忆丧失、意识障碍及人格变化为临床特征的中枢神经系统退行性疾病,也是最常见的一种老年痴呆。其主要的病理改变是在边缘叶及相关皮质有老年斑(senile plaque,SP)沉积、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NTFs)形成及神经元丢失。关于AD的发病机制有多种假说,而其中的Aβ毒性学说为多数人认可。
　　 1999年Schenk等人用人工合成的Aβ42免疫治疗AD转基因动物模型,产生了特异性的抗Aβ42抗体,阻止和减少了淀粉样斑块的形成,而且提高了接种鼠的认知能力。随后其他实验室也证实Aβ42免疫的有效性。2000年美国Elan公司在英国开始了AD疫苗的Ⅰ期临床试验,并取得了良好的效果。但是2002年以Aβ42为疫苗的临床Ⅱ期实验中,约6％病人出现了脑膜炎症状。分析认为,A42肽C末端的T细胞表位激发了Th1反应从而出现炎症反应。因此,在随后对AD的免疫治疗中,研究者们从抗原表位的选择、载体的选择、佐剂的选用以及免疫途径、方式进行了优化,避免机体产生针对Aβ42全肽的Th1型免疫反应,诱导免疫反应向Th2方向发展,从而促使机体丰动产生针对Aβ42 N末端的抗体来清除并阻止Aβ沉积。本课题组近年来采用合成的Aβ1-15为抗原,在小鼠、大鼠、转基因鼠Tg2576、恒河猴等动物上证实了该抗原可以有效的减少老年斑的沉积,改善模型鼠的学习记忆功能。此外,本研究室通过大肠杆菌制备的基因工程4 Aβ1-15疫苗和重组4Aβ1-15腺病毒疫苗治疗Tg2576鼠也取得了良好的效果。但是,这些AD疫苗还存在一些缺陷:1)以病毒为载体的疫苗在安全上还存在一定的风险。2)通过大肠杆菌制备的AD疫苗在N端和C端带有一些非特异性序列,针对这些缺陷,本研究在前期研究的基础上,仍然保留了B细胞抗原决定簇Aβ1-15,以柔性肽连接四个Aβ1-15抗原片段。采用毕赤氏酵母表达系统制备了4 Aβ15疫苗,此重组4Aβ15疫苗的N端和羧端不带有其他非特异序列。用重组4Aβ15疫苗免疫接种野生型C57BL/6鼠,观察其免疫学特性,为重组四价Aβ1-15疫苗的进一步研究打下基础。
　　 材料与方法
　　 1、重组4Aβ15在酵母中的高效表达
　　 以本研究室保存的pQE4 Aβ15为模板,PCR扩增4 Aβ15基因,并将其克隆到pMD18T载体中。将pMD18T上的4Aβ15基因片段用XhoI和XbaI酶切下,用胶回收试剂盒回收,同样用Xhol和Xbal酶切质粒pGAPZaA,回收大片段,然后进行定向连接反应,进行双酶切鉴定,鉴定正确的送去测序.序列正确的命名为pGAPZa4Aβ15。大量制备重组质粒pGAPZa4Aβ15,以限制性内切酶AvrⅡ单酶切线性化,电激转化毕赤酵母GS115感受态细胞,转化物涂布于Zeocin100μg/mL的YPD平板上,28℃恒温培养36 h左右,挑取抗性平板上生长的菌落,进行PCR鉴定。将筛选的阳性转化子小量摇瓶后,点种于Zeocin浓度依次为500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、3000μg/mL的YPD平板进行筛选。挑取获得的抗性为Zeocin2000μg/mL的阳性菌落于YPD培养基中,28℃,250 r/min的摇床上培养,培养上清用丙酮沉淀后进行12％SDS-PAGE分析.并进一步用Western blotting和质谱分析对重组蛋白进行鉴定。
　　 2、重组4Aβ15的纯化
　　 挑取重组工程菌GS115/pGAPZa4Aβ15大量摇瓶发酵,将发酵上清进行60％饱和硫酸铵沉淀。将(NH4)2SO4.沉淀后的蛋白进行透析去盐,透析后的蛋白上样至UNOsphere柱进一步纯化,SDS-PAGE和BandScan分析纯化效果。
　　 3、重组4Aβ15疫苗接种C57BL/6鼠的免疫特性研究
　　 重组4Aβ15通过皮下接种6～8周野生型C57BL/6小鼠,每2周一次,每次用量100μg,一共持续接种4个月,每次接种后第7天通过尾静脉取血约150μL。间接ELISA法检测小鼠血清中抗Aβ42抗体的水平,Westemblot检测抗体的特异性,免疫组化鉴定血清中抗Aβ抗体与鼠SP能否结合。最后一次免疫后1周,心脏取血,分离脾脏细胞,流式细胞术检测T淋巴细胞中IFN-γ和IL-4的水平。
　　 4、HE染色观察疫苗的安全性
　　 结果：
　　 1、重组4Aβ15在酵母中的高效表达
　　 构建的高效表达重组工程菌GS115/pGAPZa4Aβ15,无需诱导,直接将重组4Aβ15分泌入发酵上清,SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量为18Kd,与重组4Aβ15的分子量不一致,经Western blotting与质谱分析证实重组蛋白为4Aβ15。
　　 2、重组4Aβ15的纯化
　　 重组工程菌GS115/pGAPZa4Aβ15发酵上清进行60％饱和硫酸铵,将(NH4)2SO4沉淀后的蛋白进行透析去盐,透析后的蛋白上样至UNOsphere柱进一步纯化,获得纯度达90％,浓度为0.6 mg/ml的重组4Aβ15。
　　 3、重组4×Aβ15疫苗接种C57BL/6鼠的免疫特性观察。
　　 重组4Aβ15诱导C57BL/6鼠产生了高滴度的Aβ特异性的抗体,4×Aβ15组小鼠抗体滴度达到78.37±21.81μg/ml。免疫组化显示血清中的抗体可以和老年斑特异结合。接种重组4×Aβ15组小鼠和接种PBS组小鼠比较,脾细胞中IL-4的含量增加(P<0.001),而IL4的含量减少(P<0.005),说明疫苗引起了Th2型的免疫反应。
　　 4、HE染色光镜下各器官组织结构无异常。
　　 结论
　　 1、成功构建了高效分泌表达工程菌株GS115/pGAPZa4Aβ15。
　　 2、工程菌GS115/pGAPZa4Aβ15发酵上清经60％硫酸铵沉淀、透析以及Unosphere柱,获得纯度为90％,浓度为0.6mg/ml的重组4Aβ15疫苗。
　　 3、4×Aβ15诱导C57BL/6鼠产生了高滴度特异性的抗Aβ抗体,且能与鼠老年斑结合。
　　 4、疫苗能诱导机体产生更向Th2方向极化的免疫反应。从而可能避免出现Th1细胞极化优势的细胞免疫应答所引起的不良反应。
　　 5、重组4Aβ15疫苗接种C57BL/6显示出良好的安全性,其脑、肝和肾脏的形态及功能未出现损伤或损害。

目录

文摘

英文文摘

英文缩略词表

前言

1 AD免疫治疗的研究进展

1.1 被动免疫研究进展

1.2 第一代AD疫苗存在的问题

1.3 AD主动免疫研究进展

2 本研究的目的和意义

第一章 重组四价Aβ1-15在酵母中的高效表达及纯化

1 实验材料

1.1 菌株和质粒

1.2 分子生物学实验常用酶和试剂盒

1.3 分子生物学常用试剂

1.4 主要仪器设备

2 方法

2.1 4Aβ1-15基因的克隆与测序

2.2 表达载体pGAPZaA4Aβ15的构建

2.3 工程菌GS115/pGAPZα-A4Aβ15的构建与筛选

2.4 Zeocin高抗性转化子的筛选

2.5 Western blot分析

2.6 重组蛋白的质谱分析

2.7 重组蛋白的纯化

3 结果与分析

3.1 4Aβ15基因的克隆与测序

3.2 表达载体pGAPZaA4Aβ15的构建

3.3 毕赤氏酵母GS115阳性转化子的鉴定

3.4 Zeocin高抗性转化子的筛选与鉴定

3.5 最适发酵时间的确定

3.6 重组蛋白的鉴定与分析

3.7 重组4Aβ15的硫酸铵沉淀

3.8 Unosphere 柱纯化重组4Aβ15

3.9 纯化的4Aβ15的定量分析

第二章 重组4Aβ15的免疫学特性研究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 实验动物及疫苗接种

1.3 血清的制备

1.4 间接ELISA检测C57BL/6鼠血清中抗Aβ42抗体的效价

1.5 Western Blot法检测C57BL/6小鼠血清中抗Aβ42抗体的特异性

1.6 血清中抗A β抗体与鼠SP的结合

1.7 rAβ1-15疫苗接种后C57BL/6小鼠Th细胞反应类型的观察

1.8 脑、肝脏和肾脏的HE染色

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 C57BL/6小鼠血清中抗Aβ42抗体的水平

2.2 疫苗接种后血清中特异性抗体Western Blot结果

2.3 疫苗接种后血清和老年斑结合的结果

2.4 重组4×Aβ15疫苗接种C57BL/6后脾脏中T淋巴细胞中细胞因子IFN-γ和IL-4水平检测

2.5 重组4×Aβ15疫苗的安全性评估

3 讨论

3.1 基因工程疫苗宿主细胞的选择

3.2 电转化法

3.3 重组4×Aβ15疫苗的分子量的确定

3.4 重组四价Aβ1-15疫苗的Th2极化优势

3.5 未来Aβ疫苗的发展方向

小结

参考文献

个人简历及工作业绩

致谢