PCR方法鉴定牛胚胎性别技术的研究

摘要

本试验研究了PCR方法鉴定牛胚胎性别技术，并优化了PCR反应体系和反应条件，以期该技术能在生产中得到应用。试验结果如下：试验设计合成了4对牛Y染色体特异引物B90、B12、B34、B56和3对牛常染色体特异引物A34、A56、A78，并引用了1对牛Y染色体特异引物B78和1对牛常染色体特异引物A12。利用这些引物分别对牛基因组DNA、体外培养的牛成纤维细胞进行PCR扩增，筛选出了2个扩增效果较好的引物组合，分别为A12/B34和A12/B78。　　利用引物组合A12/B34建立了基本的PCR反应体系，研究了该反应体系中引物的浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、酶含量以及退火温度、循环次数对PCR扩增效果的影响。　　本试验首次采用两温度循环PCR方法对牛早期胚胎样品进行性别鉴定。PCR反应程序省去延伸步骤，变性和退火时间都为1秒，PCR运行时间缩短为37分钟左右，几乎将PCR扩增时间缩短到了极限，而扩增的效果仍然很好。具体的反应程序为：94℃预变性4分钟，(94℃变性1秒，56℃退火1秒)×30循环，然后延伸3分钟。　　本试验共鉴定了27枚胚胎的性别，结果为14枚雌性胚胎，13枚雄性胚胎。所有胚胎全部移植，14头受体牛妊娠，妊娠率51.9％(14/27)。已出生牛犊6头，3雌3雄，性别符合率为100％。　　另外，还用所有的牛Y染色体特异引物和牛常染色体引物A12分别对雄性牦牛、绵羊、山羊、小鼠以及人的基因组DNA进行了同源检测，发现对牛基因组DNA扩增良好的引物对牦牛基因组DNA扩增效果也很好，所有引物对其他物种却没获得相应的扩增产物。表明，牛与牦牛间同源性较高，而与其它物种间同源性较低。没有获得人的同源扩增产物表明可以排除操作人员的污染问题。

目录

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第一章文献综述

1.1哺乳动物性别控制的原理

1.1.1哺乳动物的性别决定

1.1.2哺乳动物性别决定基因的研究进展

1.2哺乳动物性别控制技术

1.2.1 X、Y精子的分离

1.2.2早期胚胎的性别鉴定

1.3 PCR方法

1.3.1 PCR技术简史

1.3.2 PCR技术的原理

1.3.3 PCR反应体系

1.3.4 PCR反应条件

1.3.5 PCR反应特点

第二章材料与方法

引言

2.1材料与仪器

2.1.1试验材料

2.1.2主要仪器设备

2.1.3试剂和酶

2.1.4主要试剂的配制

2.2实验方法

2.2.1取样

2.2.2 PCR反应体系的建立和优化

2.2.3牛胚胎性别鉴定与移植

第三章试验结果

3.1血样中提取的牛基因组DNA

3.2不同引物对几种动物的同源扩增结果

3.3引物及引物组合的筛选结果

3.4 PCR反应体系和反应条件的优化

3.5牛基因组DNA和成纤维细胞的性别鉴定结果

3.6克隆胚胎的性别鉴定结果

3.7牛胚胎性别鉴定及胚胎移植结果

第四章讨论

4.1 PCR反应模板的制备

4.2 PCR反应的污染问题

4.3引物的筛选

4.4多重PCR反应体系和反应条件的优化

4.5 PCR反应程序

4.6结论

参考文献

致谢

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