牛胚胎体外生产影响因素及LAMP法快速鉴定胚胎性别的研究

摘要

本试验从屠宰场废弃的牛卵巢表面抽取直径在2～6mm的卵泡的卵泡液,并从卵泡液中分拣出外被多层卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体(COCs),然后对COCs进行成熟培养、体外受精和受精后胚胎的体外培养直至囊胚。随后,以LAMP(环介导恒温扩增)方法为依托对生产胚胎进行性别鉴定,该方法省时、简便,准确率高,具体内容包括以下几部分： 1.EGF对牛卵母细胞体外成熟的影响、肝素对卵裂率和胚胎发育的影响、不同的培养体系对胚胎体外发育的影响 (1)在成熟培养液中加入不同浓度的EGF后均能提高卵母细胞的成熟率,随着EGF浓度的增加,卵母细胞的成熟率也随之提高。添加30ng/mLEGF组的卵母细胞的成熟率为64.41％,与对照组之间差异不显著(P>0.05);添加50ng/mL与70ng/mLEGF组间的成熟率差异不显著(P>0.05),但均显著高于对照组与30 ng/mLEGF组(P<0.05)。 (2)不同浓度肝素处理受精液后,对卵裂率有显著影响,特别是当肝素浓度为5μg/mL时,卵裂率仅为53.93％,显著低于其他组(P<0.05).其他三组卵裂率随肝素浓度增加依次升高,分别为67.22％,73.08％,76.50％,差异不显著；肝素浓度为80μg/mL时,囊胚率为22.22％,与其他三组差异显著(P<0.05),其他组囊胚率分别为33.33％,32.23％,35.96％。 (3)分别用mSOF+颗粒细胞共培养体系和M199+颗粒细胞共培养体系培养卵母细胞,两种培养体系在卵裂率方面差异不显著(P>0.05),M199+颗粒细胞组囊胚率(25.00％)与mSOF+颗粒细胞共培养组囊胚率(36.09％)间差异显著(P<0.05),说明本试验条件下mSOF+颗粒细胞共培养的培养体系更适合牛胚胎的体外发育。 2.以LAMP方法为基础,对生产的体外胚胎进行性别鉴定 本试验优化了环介导恒温扩增方法,以牛基因组为模板,设计了牛雄性特异性和牛特异性LAMP引物,并且优化了其反应条件,使LAMP在最佳的条件下进行扩增,快速鉴定基因组性别。同时本试验不再以琼脂糖凝胶电泳作为结果的检测手段,而是通过向LAMP反应后的PCR管中加入EB,CuSO4,从而形成颜色变化、沉淀的有无,直接通过裸眼进行鉴定,整个操作过程在1h左右完成。通过该方法对56个样品(牛胚胎)进行鉴定,敏感率和准确率达到100％(当取样细胞超过3个时)。本方法操作简便,准确率高,成本低廉,适合现场操作。

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论文说明：缩略语表

声明

文献综述部分第一章牛体外受精技术的研究进展

1牛卵母细胞的体外成熟培养

1.1牛卵母细胞的主要来源

1.2牛卵母细胞体外成熟培养的影响因素

2卵母细胞的体外受精

2.1精子的体外获能

2.2卵母细胞的成熟情况

3胚胎的体外培养

3.1培养液的该进

3.2培养体系的改进

4小结

文献综述部分第二章分子生物学法进行哺乳动物早期胚胎性别鉴定的研究进展

1核酸探针法

2荧光原位杂交法(FISH)

3聚合酶链反应(PCR)法

3.1 PCR的原理

3.2 PCR方法进行胚胎性别鉴定

4 LAMP法

4.1 LAMP法的引物设计

4.2 LAMP法的扩增机制

4.3 LAMP法的试剂

4.4 LAMP法的特点

4.5改良LAMP法

4.6 LAMP结果的检测

4.7 LAMP法的应用

5小结

试验研究部分第三章牛胚胎的体外生产

1材料

1.1试验材料

1.2主要仪器及设备

1.3主要试剂

1.4操作液

2方法

2.1卵巢的收集与保存

2.2卵母细胞采集

2.3卵母细胞的筛选与分级

2.4卵母细胞成熟培养

2.5颗粒细胞单层(GCM)制作

2.6卵母细胞成熟判定

2.7精子的体外获能

2.8卵母细胞体外受精

2.9受精卵体外发育培养

3试验设计

4数据处理

5结果

5.1 EGF对卵母细胞体外成熟的影响

5.2肝素对卵裂率和胚胎发育的影响

5.3不同的培养体系对胚胎体外发育的影响

6讨论

6.1 EGF对卵母细胞体外成熟的影响

6.2肝素对卵裂率和胚胎发育的影响

6.3不同的培养体系对胚胎体外发育的影响

7小结

试验研究部分第四章环介导恒温扩增方法的研究

1材料

1.1试验材料

1.2主要试剂

1.3仪器设备

1.4试剂配置

2方法

2.1血样DNA的提取(酚-氯仿法)

2.2引物设计

3试验设计

4结果

4.1优化LAMP的反应条件和反应体系

4.2引物特异性的研究

5讨论

5.1不同浓度Betaine对反应结果的影响

5.2不同反应温度对反应结果的影响

5.3不同反应时间对反应结果的影响

5.4不同Mg2+浓度对反应结果的影响

5.5不同浓度BIP(FIP)对反应结果的影响

5.6环引物LB和LF对反应结果的影响

5.7不同浓度的F2(B2)对反应结果的影响

5.8引物特异性的研究

6小结

试验研究部分第五章环介导恒温扩增结果的快速鉴定

1材料

1.1试验材料

1.2主要试剂、仪器设备、试剂配置、DNA的提取和LAMP引物设计

1.3 PCR引物设计和反应条件

2方法

2.1 LAMP结果的鉴定

2.2平行检测

3结果

3.1核酸染料(EB)法

3.2硫酸铜共沉淀法

3.3 LAMP结果的琼脂糖凝胶电泳检测和PCR平行检测

3.4对LAMP快速鉴定方法准确性的研究

4讨论

5小结

试验研究部分第六章环介导恒温扩增在牛胚胎性别鉴定中的应用

1材料

1.1试验材料

1.2主要试剂、仪器设备和试剂配置

2方法

2.1胚胎取样和取样细胞DNA的提取

2.2引物设计，溴化乙锭(EB)和硫酸铜检测结果和琼脂糖凝胶电泳

3试验设计

4结果

5讨论

6小结

参考文献

全文结论

图 版

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致 谢