MiR-486调控造血系统低氧反应的作用与机制

摘要

低氧可以影响细胞生长因子的分泌及分化等生物学特性。造血系统是人类对低氧环境适应的最敏感的组织之一，也是研究细胞低氧反应的理想模型。微小 RNA（microRNA，miRNAs）可以通过调控功能基因的表达而在细胞的低氧反应中发挥重要作用。其中，微小 RNA-486（microRNA-486，miR-486）是首先从人的胎肝组织中鉴定发现的miRNAs，其被证实与造血细胞红系分化密切相关。而众所周知低氧环境可以促进骨髓红细胞的生成过程，因此，我们推测miR-486可能参与了低氧环境下骨髓造血的过程。人类对于低氧环境的适应包括造血干细胞的适应以及造血微环境的适应。目前，miR-486在骨髓低氧适应中的作用尚不明确，本研究论文以造血微环境中的重要细胞—骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)及造血细胞系TF-1细胞作为研究对象，旨在研究miR-486在骨髓低氧适应中的作用及机制。本研究分为两个部分：
　　第一部分：MiR-486调控骨髓间充质干细胞低氧反应的作用及机制。
　　目的：探索miR-486在调控骨髓造血微环境的重要细胞BM-MSCs低氧反应中的作用，并研究其对 BM-MSCs血管生成因子分泌及细胞存活中的作用及机制。
　　方法：⑴用Ficoll法分离健康成年人骨髓中的单个核细胞，通过贴壁生长获得BM-MSCs；⑵用qRT-PCR检测不同培养条件下BM-MSCsmiR-486的表达；⑶用qRT-PCR和ELISA检测不同培养条件下BM-MSCs细胞因子的表达与分泌；⑷用慢病毒感染技术将 BM-MSCs miR-486过表达或沉默；⑸细胞的生物学特性，包括增殖、凋亡及迁移，均应用了商业试剂按照说明书检测；
　　结果：研究显示我们成功分离、培养、扩增了BM-MSCs；低氧可以促进 BM-MSCs miR-486的表达；与感染对照病毒的BM-MSCs相比，过表达 miR-486可以促进 BM-MSCs细胞因子的分泌及细胞增殖，抑制细胞凋亡；而沉默 miR-486可以抑制 BM-MSCs细胞因子分泌，促进细胞凋亡；MiR-486通过调控 PTEN-PI3K/AKT信号通路调节 BM-MSCs的生物学特性。
　　结论：MiR-486是一种新发现的低氧相关miRNAs，可以通过PTEN-PI3K/AKT信号通路调节BM-MSCs的生物学特性。
　　第二部分：MiR-486调控造血细胞增殖、分化及糖代谢的作用及机制。
　　目的：探讨miR-486在红系白血病细胞 TF-1细胞低氧反应中的调节作用，及其对 TF-1细胞增殖、分化及糖代谢等生物学特性的影响。
　　方法：⑴将TF-1细胞进行低氧处理，用qRT-PCR检测 miR-486、pri-miR486、HIF-1α、HIF-2α、Sirt1的表达，用流式细胞仪检测了TF-1细胞CD235a的表达；⑵用慢病毒感染技术将 TF-1过表达miR-486，用qRT-PCR及Westernblot检测Sirt1的表达，用qRT-PCR检测 Glut1、Glut4等糖代谢相关基因的表达，用Dye670染色法及 CCK8法检测 TF-1的增殖；⑶用慢病毒感染技术将TF-1沉默 miR-486，用qRT-PCR及 Western Blot检测 Sirt1的表达，用qRT-PCR检测了Glut1、Glut4等糖代谢相关基因的表达，用Dye670染色法及 CCK8法检测 TF-1的增殖,用流式细胞仪检测 TF-1细胞CD235a的表达及红系分化；⑷用慢病毒感染技术将 TF-1细胞沉默Sirt1后用qRT-PCR及WesternBlot检测Sirt1的表达，用qRT-PCR检测了Glut1、Glut4等糖代谢相关基因的表达，用Dye670染色法及CCK8法检测TF-1的增殖；用流式细胞仪检测TF-1细胞 CD235a的表达及红系分化。
　　结果：低氧可以促进TF-1细胞miR-486、pri- miR486、HIF-1α、HIF-2α的表达，抑制 Sirt1的表达；低氧可以促进 TF-1细胞的红系分化能力；与感染对照病毒的TF-1细胞相比，miR-486过表达抑制TF-1细胞Sirt1的表达，促进 Glut1、Glut4的表达，并可以促进 TF-1增殖；与感染对照病毒的TF-1细胞相比，miR-486沉默后促进TF-1细胞 Sirt1的表达，抑制Glut1和Glut4的表达，抑制 TF-1增殖，抑制 TF-1红系分化；与感染对照病毒的TF-1细胞相比，Sirt1沉默促进 Glut1和 Glut4的表达，促进 TF-1红系分化。
　　结论：miR-486可以调控造血细胞TF-1细胞的增殖、分化及糖代谢过程，其调控TF-1分化、糖代谢的过程可能是通过调控Sirt1的表达来实现的。

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引言

第1章. MiR-486调控骨髓间充质干细胞低氧反应的作用及机制

1.1 BM-MSCs的分离、培养和鉴定

1.1.1 实验材料

1.1.2实验方法

1.1.3实验结果

1.1.4结论

1.2 低氧对BM-MSCs生物学特性的影响

1.2.1实验材料

1.2.2实验方法

1.2.3实验结果

1.2.4结论

1.3 MiR-486在BM-MSCs低氧反应中的作用

1.3.1实验材料

1.3.2实验方法

1.3.3实验结果

1.3.4 结论

1.4 MiR-486调控BM-MSCs低氧反应的机制

1.4.1 实验材料

1.4.2 实验方法

1.4.3 实验结果

1.4.4结论

1.5 讨论

第2章. MiR-486调控造血细胞增殖、分化及糖代谢的作用及机制

2.1低氧对造血细胞TF-1 miR-486表达的影响

2.1.1 实验材料

2.1.2实验方法

2.1.3 实验结果

2.1.4结论

2.2 miR-486对TF-1细胞增殖、分化及糖代谢的影响

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.2.3 实验结果

2.2.4 结论

2.3 Sirt1沉默对TF-1细胞增殖、分化及糖代谢的影响

2.3.1 实验材料

2.3.2 实验方法

2.3.3 实验结果

2.3.4结论

第4节 外泌体在miR-486调控TF-1细胞红系分化中的作用

2.4.1 实验材料

2.4.2 实验方法

2.4.3 实验结果

2.4.4 结论

2.5 讨论

参考文献

致谢

附录

综述:低氧对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

作者简历