酪氨酸激酶Pyk2在大鼠和小鼠卵母细胞减数分裂过程中的定位和功能研究

摘要

哺乳动物卵巢中的卵母细胞的发育停滞在第一次减数分裂前期的双线期.在周期性激素的作用下,一部分卵母细胞恢复减数分裂,发育到第二次减数分裂中期(MII期)排卵.直至受精或孤雌活化,卵母细胞才能最终完成减数分裂.哺乳动物卵母细胞减数分裂是受多种细胞外信号调节的复杂过程,在这一过程中蛋白激酶通过调节蛋白质的磷酸化发挥着重要的作用.但是,人们的研究多数集中在丝/苏氨酸蛋白激酶的功能上,而对酪氨酸激酶--另一类重要的蛋白激酶的研究却很少.富含脯氨酸的酪氨酸激酶(Proline-rich tyrosine kinase,Pyk2)是一种非受体酪氨酸激酶,属于粘着斑激酶家族(Focal adhesion kinasefamily)成员.Pyk2在多种组织和细胞中表达,能感受多种物理和化学的细胞外信号而激活,参与胞内信号传递,在细胞粘附、迁移、生存、增殖、凋亡、分化等生理过程中发挥重要作用.然而,Pyk2是否在卵母细胞中表达并行使某种功能还不清楚.为了解答这些问题,本研究应用免疫荧光化学、蛋白质免疫印迹、抗体显微注射、药物处理等方法对大鼠和小鼠卵母细胞减数分裂过程中Pyk2的定位及功能进行了初步的研究和探索.这一研究对阐明哺乳动物卵母减数分裂的分子机制具有重要的理论意义. 在大鼠卵母细胞中我们利用蛋白质免疫印迹的方法首次检测到Pyk2和第402位酪氨酸残基磷酸化的Pyk2(Tyr402p-Pyk2)的表达.免疫荧光化学定位的研究发现,在生发泡期(GV期)的大鼠卵母细胞中Pyk2和Tyr402p-Pyk2定位于卵皮质区及细胞核周围的卵胞质中,Pyk2还存在于生发泡中.生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)后,Pyk2及Tyr402p-Pyk2分布在卵皮质和染色体周围的细胞质中.减数分裂后期和第二次减数分裂中期的定位相似,Pyk2和p-Pyk2分布在细胞质中和皮质区,在减数分裂纺锤体周围及其定位的皮质区有更多的Pyk2和p-Pyk2聚集.第一次减数分裂的末期,除了胞质中和皮质区的定位外,还观察到大量Pyk2和p-Pyk2集中在卵裂沟的位置.对微丝进行荧光染色后发现大鼠卵母细胞成熟过程中Pyk2与微丝的定位非常相似,利用两种抗体共同标记的方法研究发现,Pyk2或p-Pyk2与微丝在大鼠卵母细胞减数分裂成熟的多个阶段存在共定位现象.另外,向GV期卵母细胞中注射抗Pyk2抗体破坏了微丝的聚集并抑制了第一极体的排放,使减数分裂发生阻滞.这些结果表明Pyk2在大鼠卵母细胞成熟过程中表达,并活化,可能参与了微丝组装调节,对大鼠卵母细胞极性的确立、第一极体的排出具有重要的作用. 应用免疫荧光化学方法研究小鼠卵母细胞发现,刚从卵泡中释放出的GV期小鼠卵母细胞中,Pyk2在整个细胞质中及除核仁以外的细胞核中均匀分布,在体外培养的过程中,Pyk2逐渐向细胞核中集中,发生GvBD前,Pyk2分布在开始凝集的染色体上.GVBD后,直至整个MII期,Pyk2都均匀地分布在整个细胞质中.Tyr402p-Pyk2在刚从体内取出的GV期卵母细胞中不表达,直到体外培养1小时后才发现p-Pyk2分布在除了核仁外的整个卵母细胞中,GVBD后至第二次减数分裂中期, p-Pyk2始终均匀分布在整个细胞质中.对Pyk2在受精卵中亚细胞定位的研究发现,无论是体内受精还是体外受精,在精子穿入引发的第二次减数分裂后期,Pyk2比较均匀地分布在整个细胞质中.在排出第二极体和雄原核形成的过程中,Pyk2除了在受精卵细胞质中分布外,还与精子头部的染色体密切相关.雌雄原核融合形成合子时,Pyk2又定位在合子的细胞核中.为了进一步了解Pyk2在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的功能,分别用Pyk2抑制剂水杨酸钠抑制Pyk2活性和抗Pyk2抗体显微注射的方法处理卵母细胞后,观察生发泡破裂和极体排放的情况.结果发现,水杨酸钠剂量依赖性地抑制了小鼠卵母细胞GVBD和极体的排放,而抗Pyk2的抗体显微注射入GV期小鼠卵母细胞中却没有阻止GvBD的发生和第一极体的排放.这些相互矛盾的结果说明Pyk2的抑制剂不仅抑制了Pyk2的活性也可能抑制了其它参与卵母细胞减数分裂的蛋白质或酶的活性.另外,为了研究Pyk2是否受到Ca<'2+>和蛋白激酶C(PKC)的调节,我们分别用钙离子载体A23187和PKC的激活剂PMA处理MII期卵母细胞,发现Pyk2的分布形态有所改变.以上这些结果说明Pyk2在整个小鼠卵母细胞成熟和受精过程中表达,在体外培养1小时后402位酪氨酸残基被激活,并且整个成熟过程都处于活化状态;与染色体的共定位说明Pyk2可能参与了GV期卵母细胞染色体的凝集以及受精后精子染色体的解凝集;抑制了Pyk2的活性并不能抑制生发泡破裂和极体的排放;Pyk2可能受到Ca<'2+>矿和PKC的调节。

目录

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第一篇论文综述

第一章哺乳动物卵母细胞减数分裂的阻滞、恢复和成熟

第二章酪氨酸激酶PYK2研究进展

参考文献

第二篇研究论文

第一章Pyk2在大鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中的定位和功能研究

1.引言

2.材料与方法

3.实验结果

4.分析讨论

图版

第二章Pyk2在小鼠卵母细胞成熟和受精过程中的定位和功能研究

1.引言

2.材料与方法

3.实验结果

4.分析讨论

图版

参考文献

缩略语表

致谢

攻读博士学位期间发表的文章