盐芥激活标签突变体库的构建和筛选及盐芥ftsH8基因功能研究

摘要

随着盐芥基因组测序的即将完成，功能基因组学研究将会成为研究工作的重点，而通过基因标签法建立大规模的突变体库是目前植物功能基因组学研究中最直接有效的方法。其中，激活标记法不仅能产生一般意义的功能丧失突变体，更重要的是能得到功能获得突变体，对于功能冗余基因以及生命周期多阶段必需基因的研究具有独特的优势。 本实验以植物耐盐模式植物盐芥为研究材料，通过农杆菌介导的花浸染法将激活标记载体pSKI015转化入盐芥基因组，试图建立盐芥激活标记突变体库。在盐芥春化及移栽过程中发现，完成春化且营养生长越好的植株移栽成活率较高，浸染后收的种子多。浸染间隔以5-6天为宜。采用TAIL-PCR的方法进行农杆菌T-DNA插入盐芥基因组侧翼序列的扩增，并进行了测序。 由于盐芥转化效率很低，通过喷洒0.2％Basta溶液，获得380株抗性苗。采用TAIL-PCR的方法，对65株激活标记突变体插入位点的侧翼序列进行扩增，经过三轮反应有23株能扩增出符合测序条件的侧翼序列。在进行TAIL-PCR的过程中发现，采用3个特异引物结合5个AD兼并引物只能扩增出30％左右的突变体的侧翼序列。其中，AD3兼并引物扩增成功率最高，在40％以上，而且得到的特异条带数也比较少，因而可以优先选择AD3进行TAIL-PCR。通过pMD18-Tvector连接检测后进行测序的方法，目前得到7个测序结果。 本实验仅对盐芥激活标记突变体库的建立进行了初步的工作，大规模的突变体库正在构建之中。利用TAIL-PC虽能扩增出侧翼序列，但TAIL-PCR扩增的条件仍需进一步完善。 FtsH蛋白酶是一种兼具ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侣活性的兼职蛋白，在生物体内具有重要功能。原核生物中的FtsH蛋白酶多为胁迫诱导型；在高等植物中，FtsH蛋白酶与光胁迫、低温以及病害等密切相关。 为了研究盐芥ThftsH8的功能，对已转入ftsH8-RNAi盐芥转化子进行低温强光处理，植株外观表现为叶片黄化，推断突变体出现黄化现象与ftsH8基因沉默有关。机理可能是ThftsH8受低温诱导表达，其编码蛋白参与盐芥低温耐受性和类囊体的发育。ThftsH8-RNAi转化子在低温强光条件下，由于基因沉默导致ThftsH8编码蛋白的减少而出现黄化现象；伴随温度回升，ThftsH8诱导表达条件丧失，相应的ThftsH8-RNAi转化子黄化现象有所减弱。 本实验是对ftsH8基因功能的初步探讨，进一步的研究以后将深入展开。

目录

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英文文摘

声明

第一部分 文献综述

1.植物功能基因组学

1.1功能基因组学的研究内容

1.2功能基因组学的主要研究技术

2.突变体诱变技术的研究进展

2.1自发突变产生突变体

2.2物理化学法诱变突变体

2.3 DNA标签法诱变突变体

3.激活标签

3.1激活标签和功能基因的冗余

3.2由激活标签识别的过量表达的突变体

3.3激活标签的展望

4.基因沉默

5.ftsH8基因研究进展

5.1 ftsH8基因家族和表达

5.2 FtsH的结构

5.3叶绿体FtsH的生物学功能

5.4从ftsH8基因灭活和过量表达中得到的信息

5.5 FtsH作用机制

第二部分实验论文

第一章盐芥激活标签突变体库的筛选与构建

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果及分析

4.讨论

第二章 盐芥基因ftsH8功能研究

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

攻读学位期间发表的文章

致 谢