构建Ectoine生物合成基因整合表达工程菌株及其耐盐能力测定

摘要

目的 利用新一代高通量测序技术初步解析青藏高原茶卡盐湖水样和底泥中细菌和古菌群落结构及多样性并对深入挖掘茶卡盐湖的微生物种质资源；利用原核异源表达技术，构建四氢嘧啶合成基因簇 promoter+ectABC 克隆载体(pMD18-T-promoter+ectABC)和表达载体(pET-28a(+)-promoter+ectABC、pColdⅠDNA-promoter+ectABC)，最终检测重组表达菌株的耐盐生长能力。 方法 使用 DNA 提取试剂盒对茶卡盐湖水样和底泥混合物进行总 DNA 的提取，参照样本的测序质量要求对其进行相应比例的混合后进行高通量测序，数据分析细菌和古菌群落结构及多样性和优势菌种；以模式菌株 Halomonas sp. QHL1全基因组为模板对promoter+ectABC基因簇序列PCR扩增，成功构建克隆表达重组质粒，IPTG诱导表达，SDS-PAGE对目的蛋白进行检测，耐盐梯度实验对重组菌株的耐盐能力进行检测，为后期实验提供一定基础。 结果 获得细菌和古菌总有效序列分别为117192和110571条；细菌和古菌的物种注释(Operational taxonomic unit，OTU)数目分别为421和317，获得分类地位明确的细菌种类为14门28纲170属，古菌为5门4纲34属；细菌的优势种属为芽孢杆菌属 Bacillus (41.94%)，古菌的优势菌是 Halonotius (17.21%)。成功获得重组表达菌株，目的基因序列大小为3335 bp (包括上游420 bp的启动子及调控序列)。SDS-PAGE显示：ectA、ectB和ectC三个基因编码的氨基酸分别对应192、422和129 kD，与预测结果相一致。盐梯度实验表明：与E.coli BL21空白菌株对照相比，重组菌株耐盐度提高了50%。 结论 初步揭示了茶卡盐湖中细菌和古菌的群落结构及物种多样性，为嗜盐菌的开发及后续微生物资源的挖掘提供了理论依据；成功克隆了promoter+ectABC基因簇，构建重组表达菌株，为promoter+ectABC基因簇在菌株工业过量化生产中所发挥的重要作用提供基础实验依据。

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