从原始生殖细胞中分离克隆鸡胚胎生殖细胞

摘要

原代培养时采取与同源生殖腺基质细胞共同培养的方式,继代培养时采用原代鼠胚成纤维细胞(primary mice embryonic fibroblast,PMEF)、原代鸡胚成纤维细胞(primary chicken embryonic fibroblast,PCEF)、STO细胞及SNL细胞为饲养层,以高糖DMEM添加2％鸡血清,0.1mMβ-巯基乙醇,2mML-谷氨酰胺,10mMHEPES(PH7.6),100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素,10ng/mL庆大霉素,20ng/mL伴白蛋白,胎牛血清及细胞凶子为培养基,以孵化4.5~7.5日龄(37.8℃、RH60％、60°翻蛋角,每小时翻蛋1次)的鸡胚生殖腺为实验材料,探讨影响鸡原始生殖细胞(Primordial GermCells,PGCs)分离克隆胚胎生殖细胞(Embryonic Germ Cells,EG)的相关因素.

目录

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英文缩略词

1.引言

1.1胚胎干细胞的研究进展

1.2原始生殖细胞

1.2.1 PGCs的起源

1.2.2维持PGCs全能性的分子机制

1.2.3维持PGCs全能性的信号传导途径

1.2.4 PGCs的分化

1.2.5自PGCs建立EG细胞系的优势

1.2.6自PGCs建立EG细胞系的一般方法

1.2.7 EG细胞与ES细胞的区别

1.3鸡的原始生殖细胞

1.3.1鸡胚胎的早期发育

1.3.2鸡PGCs的发生与迁移的途径和机制

1.3.3鸡PGCs的形态

1.3.4鸡PGCs的研究进展

1.3.5研究鸡EG细胞的意义

1.4本研究的目的、意义及主要内容

2.材料和方法

2.1实验动物

2.2主要仪器

2.3主要试剂

2.4有关溶液的配制

2.5主要实验方法

2.5.1 4.5～7.5d鸡胚PGCs的分离

2.5.2 CEG细胞的传代

2.5.3石蜡切片方法

2.5.4原代鸡胚成纤维细胞(PCEG)的制备

2.5.5原代鼠胚成纤维细胞(PMEF)的制备

2.5.6饲养层的制备

2.5.7 PCEF、PMEF、STO及SNL细胞的冻存与复苏

2.5.8 CEG细胞的冷冻保存及解冻

2.5.9 CEG细胞的鉴定

2.5.10血清质量的简要鉴定方法

2.6统计分析

3.结果与分析

3.1 CEG细胞的鉴定结果

3.1.1形态学鉴定

3.1.2 PAS染色结果

3.1.3 AKP染色结果

3.1.4体外分化结果

3.1.5体内分化结果

3.2 FBS浓度不同对CEG细胞分离克隆效果的影响

3.3细胞因子对CEG细胞分离克隆效果的影响

3.4饲养层对CEG细胞分离克隆效果的影响

3.5鸡胚日龄对CEG细胞分离克隆效果的影响

3.6消化时间对CEG细胞生长效果的影响

3.7左右侧生殖腺对CEG细胞分离克隆效果的影响

3.8 CEG细胞冷冻保存结果

4.讨论

4.1 FBS浓度不同对CEG细胞的影响

4.2饲养层及细胞因子对CEG细胞的影响

4.3胚胎日龄对CEG细胞分离传代的影响

4.4细胞消化液对CEG细胞生长的影响

4.5左右侧生殖腺对CEG细胞分离克隆的影响

4.6影响CEG细胞生长的其它因素

4.6.1基本培养基的选择

4.6.2添加剂的使用

5.结论

参考文献

图片及图版说明

致谢

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