小鼠原始生殖细胞在生殖嵴的定位及其与猪原始生殖细胞的分离培养

摘要

原始生殖细胞(PGCs)的发育与迁移，是哺乳动物配子发生和发育生物学的基本问题之一。PGCs的分离培养，对胚胎生殖(EG)细胞的建系是至关重要的。由于EG细胞在形态学、分子标志与体内外分化潜能等方面都与ES细胞相似，并被证实具有种系传递能力，因此，分离培养PGCs已经成为获得多能干细胞的一条重要途径。本研究以小鼠、猪胚胎为材料，对不同胚龄小鼠生殖嵴的发育进行形态学比较研究，通过对PGCs在生殖嵴中的AP染色定位观察，比较其数量的增殖规律；通过采集不同日龄昆明小鼠PGCs，探讨并优化其分离培养程序；并从猪胚胎生殖嵴中分离PGCs，进行原代培养与传代，对影响PGCs分离和培养的因素进行探讨。本研究包括如下试验：试验1小鼠胚胎不同发育阶段生殖嵴的形态学研究本试验以昆明小鼠胚胎为材料，对不同胚龄的生殖嵴进行形态学比较研究，通过对PGCs在生殖嵴中的AP染色定位观察，比较其数量的增殖规律，以期为小鼠EG细胞的分离培养提供依据。试验表明，小鼠11.5～13.5dpc胚胎，随胎龄增长生殖嵴的形态发生明显变化，由凸入体腔的原始性索渐变为椭圆形的实质性器官-性腺；AP染色表明，在这个过程中，生殖嵴内的PGCs在不同胎龄的生殖嵴内，数量明显不同，显示出随着胎龄增长，呈数量级增殖的趋势。小鼠11.5～12.5dpc胚胎为采集PGCs的最佳时期。试验2小鼠原始生殖细胞的分离培养本试验分离培养10.5～14.5dpc小鼠胚胎的PGCs，对PGCs的形态特征、体外生长特性进行了探索。试验表明：(1)对PGCs进行鉴定，结果表明分离的PGCs呈圆形或椭圆形，边缘光滑，具有折光性，AP染色呈强阳性。(2)10.5～13.5dpc的PGCs在培养5d后，集落出现高峰期。13.5dpc的PGCs，在培养3d后集落的增殖逐渐平缓；14.5dpc的PGCs则在培养3d后集落数出现下降。总体来看，11.5和12.5dpc小鼠胚胎PGCs，最适于分离培养胚胎生殖(EG)细胞。(3)通过对分离培养的EG细胞集落进行鉴定，表明其形态学特征和AP活性与小鼠ES细胞相似；本试验以STO细胞作饲养层，分离培养小鼠EG细胞，并传至第8代。(4)从传代培养结果来看，采集10.5～12.5dpc胚胎生殖嵴，不仅可获得相当数量的PGCs，集落生长也相对稳定。试验3猪原始生殖细胞的分离培养本试验采集妊娠25～27d猪胚胎的PGCs，以STO细胞作饲养层，用96孔培养板作原代培养，4孔培养板作传代培养。结果表明：(1)对分离培养的猪EG细胞集落进行形态学观察和AP染色，表明所分离的5～6代EG细胞集落形态与小鼠ES细胞类似。猪EG细胞呈多层集落状生长，无明显细胞界限，细胞体积较小，AP染色呈强阳性。(2)仅以STO细胞作饲养层，不添加任何生长因子，分离出猪EG细胞并传至9代。

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摘要

简写及缩略语

第一部分文献综述 第一章哺乳动物原始生殖细胞的发育与迁移

第一部分文献综述 第二章哺乳动物多能干细胞的研究进展

第一部分文献综述 参考文献

第二部分试验研究 第三章小鼠胚胎不同发育阶段生殖嵴的形态学研究

第二部分试验研究 第四章小鼠原始生殖细胞的分离培养

第二部分试验研究 第五章猪原始生殖细胞的分离培养

全文总结

参考文献

致谢