棉花叶片和纤维蔗糖磷酸合成酶活性变化及其基因的克隆分析

摘要

在丰抗6号、中棉45和山农棕02三个品种(系)发育的花铃期，测定它们倒一果枝第一果节的叶片和棉纤维中蔗糖含量、可溶性糖含量和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性的变化，利用电子克隆的方法，克隆了SPS基因片段，分析SPS基因mRNA水平上的表达量的变化，并对克隆的SPS基因编码氨基酸序列进行分析，获得结果如下： 1.三个品种(系)的SPS酶活性的变化在叶片和棉纤维发育过程中均出现双峰，高峰值出现在开花当天和花后18天，这两个峰值是前者大于后者，且整体变化均呈现下降趋势。SPS酶活性在丰抗6号最高，其次为中棉45，山农棕02最低。三个品种(系)的可溶性总糖含量、蔗糖含量表现同样的变化规律。 2.棉花叶片中SPS酶的活性要比棉纤维中的活性高，这说明SPS参与合成蔗糖主要发生在叶片中；在棉纤维次生壁沉淀期(即花后18天)棉纤维中的SPS酶活性的提高，这说明SPS在棉纤维次生壁合成时也起一定的作用。 3.利用RT-PCR技术，分析了花铃期棉花叶片和棉纤维SPS基因片段在转录水平上的变化，结果表明三个品种(系)叶片的SPS基因的表达量要高于棉纤维中的表达量，叶片SPS基因的表达量高，棉纤维的SPS的表达量低，这说明SPS基因主要在作为“源”的叶片中起作用。在叶片和棉纤维中，SPS基因片段的表达量在转录水平上从高到低依次为：丰抗6号、中棉45和山农棕02。 4.利用电子克隆的方法，克隆了棉花SPS基因片段，共1050bp，命为电子克隆拼接序列(e-cloning)。根据拼接的SPS基因片段，设计引物，利用PCR技术，获得SPS基因片段，经测序共980bp，命为测序片段(cexu)。电子克隆拼接序列与棉花实际克隆核苷酸序列相似性为80％，氨基酸序列相似性为75％，cexu的氨基酸序列与其他植物温州蜜桔、蚕豆、马铃薯、车前菊、甜菜、菠菜的SPS氨基酸序列相似性在60％-68％之间，并且有共同的保守区域，这些高度保守的氨基酸序列可能是SPS基因的活性位点。 5.生物信息技术分析表明已克隆的SPS基因片段包含320个氨基酸，分子量为36525.4，理论等电点pI为6.00，不稳定指数估算值为56.93，属于不稳定蛋白类。其中极性氨基酸占56％，疏水氨基酸占44％。该基因片段编码氨基酸的高级结构为混合类型，呈螺旋状的氨基酸残基占20.38％，呈折叠状的氨基酸残基占31.75％，呈环状的氨基酸残基占47.87％。第43和第114位上结合二硫键的可能性最大，预测这两个位点可能对蛋白质高级结构的形成与稳定有重要作用。预测SPS酶基因片段编码氨基酸序列有两个跨膜区域(第7-29位、第135-157位)，该酶属跨膜蛋白类，并发生跨膜运动，故有可能在细胞内和细胞外均起作用。预测该基因片段可能具有水解酶的功能。

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摘要

符号说明

1引言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

参考文献

致谢

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