Patogén Crytococcusok ellen hatásos killer toxin izolálása, jellemzése és a kódoló gén lokalizálása, klónozása Filobasidium capsulogenumban = Isolation and characterization of killer toxin active against pathogen Cryptococcus, localization and cloning of the toxin coding gene(s) in Filobasidium capsulogenum.

摘要

A basidiomycota Filobasidium capsuligenum egy olyan fehérjét szekretál, amely elpusztítja a patogén Cryptococcus neoformanst. Pályázatunkban ezen killer toxin genetikai determinánsát derítettük fel, a toxin fehérje izolálását, jellemzését valósítottuk meg, ill a toxin hatásmechanizmusát is feltártuk. Az érzékenységi tesztek alapján az FC-1 toxin specifikusan, csak a C. neoformans-ra hatott. Bebizonyítottuk, hogy e hatás citocidikus. A toxin protein természetű: hő hatására elbomlik, aktivitásának optimuma pH 4-6. A toxin receptoraként az érzékeny sejtek sejtfalának béta-1,6-glükánját határoztuk meg. E specificitást arra használtuk fel, hogy a toxint affinitáskromatográfiával tisztítsuk. A pusztulán-Sepharose 6B oszlop legaktívabb frakciójával SDS-PAGE-t végeztünk, és 3 protein sávot találtunk a 19 - 51 kDa tartományban. További kísérletek szükségesek a killer aktivitású protein azonosítására. A F. capsuligenum sejtek minilizátainak agaróz gélelektroforézisével kiderítettük, hogy az FC-1 proteint kromoszómális gén kódolja. A toxin hatásmódjának tanulmányozására a celluláris DNS mennyiségének változását a sejtciklus függvényében (DNS szintézis gátlás?) ill. a toxin kezelt sejtek FITC festődését (sejtfal bioszintézis gátlás?) vizsgáltuk. Eredményeink szerint a killing mechanizmus sem a sejtciklustól, sem pedig a sejtfal bioszintézistől nem függ. Sokkal inkább ionofor proteinként hat, amely a citoplazma membránfunkcióját rombolja. | The basidiomycetous yeast Filobasidium capsuligenum produces a killer toxin (FC-1) which is highly effective against the pathogen Cryptococcus neoformans. The goal of this project was to characterize the toxin, determine the genetic trait coding for it, and study its effect on C. neoformans cells. It was demonstrated that FC-1 toxin was specific for C. neoformans. The toxin had a cytocidal effect. FC-1 proved to be a protein: sensitive for heat and proteolytic enzymes. The optimal pH for the activity was within the range of pH 4-6. As receptor site for the killer protein beta-1,6-glucan in the cell wall of sensitive cells was determined. The specificity was used for purification of the toxin through affinity chromatography. The most active fraction from a pustulan-Sepharose 6B column was subjected to SDS-PAGE, and three protein bands, in molecular mass of 19 - 51 kDa, were detected. Additional investigations are necessary to identify the protein with killer property. Agarose gel electrophoresis of F. capsuligenum cell minilysate revealed that FC-1 protein is coded by the chromosomal DNA. Analysis of cellular DNA (inhibition of DNA synthesis?) by laser scanning cytometry and FITC staining (inhibition of cell wall biosynthesis?) of the toxin-treated cells revealed that the killing mechanism of FC-1 is neither cell cycle- nor cell wall biosynthesis-dependent; rather it might act as an ionophoric protein that disrupts the cytoplasmic membrane function.