奶牛乳腺炎病因学和金黄色葡萄球菌的分子调查及Fnbp蛋白免疫

摘要

乳腺炎是威胁奶牛业最为频繁和损失最为严重的疾病之一，世界每年因乳腺炎的损失超过350亿美元，乳腺炎主要包括临床型和隐性乳腺炎，临床型乳腺炎可引起弃奶、奶产量暂时性减少和奶牛的过早淘汰；隐性乳腺炎可引起乳腺慢性感染从而造成奶产量长期下降。尽管国内外对乳腺炎进行了大量研究，但仍存在众多不足：首先对引起乳腺炎的病原菌缺乏系统研究；针对近些年来引起乳腺炎的主要病原菌缺少快速简捷的检测方法；尤其对目前乳腺炎的主要病原菌金黄色葡萄球菌缺少分子流行病学资料；目前国内外还缺少预防金黄色葡萄球菌效果较好的疫苗；目前我国对隐性乳腺炎还缺乏重视；我国众多奶牛散养户在顽固性乳腺炎面前束手无策等等，为探讨、解决以上问题，进行了本项研究，主要结果如下： 1.对不同类型类型乳腺炎的细菌学系统分析对山东7个地区14个奶牛场做了临床型和隐性乳腺炎调查，并且采取了临床乳腺炎病牛234个乳样，隐性乳腺炎241个乳样分别做了细菌学检查，结果表明：泌乳期临床型乳腺炎病原菌以凝固酶阴性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌、链球菌、酵母菌和棒状杆菌为主；干奶期临床型腺炎病原菌以大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和酵母菌为主；隐性乳腺炎病原菌以凝固酶阴性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，链球菌、酵母菌、假单胞菌和棒状杆菌为主；厌氧菌在隐性乳腺炎、泌乳期临床型乳腺炎和干奶期临床型乳腺炎乳样的检出率分别为5.82％，4.17％，10.16％；引起隐性乳腺炎和干奶期乳腺炎细菌的共感染率较高，与引起泌乳期乳腺炎病原菌的共感染率差异极显著(P＜0.01)，引起隐性乳腺炎与引起干奶期乳腺炎病原菌的共感染率差异不显著(P＞0.05)。54个顽固性乳腺炎中酵母菌(25.92％)、大肠杆菌(12.96％)、凝固酶阴性葡萄球菌(14.81％)、链球菌(12.96％)和金黄色葡萄球菌(9.26％)占有较大的比例，但有12.96％的乳区分离不到细菌。 2.检测乳腺炎主要致病菌：金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌的多重PCR方法的建立参照Genebank发表的序列，在金黄色葡萄球菌，无乳链球菌和停乳链球菌16SrRNA与23SrRNA之间的区域设计了3对引物，参照念珠菌和隐球菌的18SrRNA的序列设计1对引物，建立了检测金黄色葡萄球菌，无乳链球菌和停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法，结果表明：本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性。参照Skladny的方法制备模拟了细菌感染临床标本，多重PCR方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度分别为104cfu/ml，检测无乳链球菌，停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为102cfu/ml，103cfu/ml和103cfu/ml。通过对临床型乳腺炎46个，隐性乳腺炎167个，共计213个乳样分别用传统细菌学培养法和多重PCR方法进行检测，与细菌培养法比较，多重PCR对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率(P＜0.01)，但该方法对无乳链球菌和停乳链球菌的检出率与培养法差异不显著(P＞0.05)。 3.奶牛临床型和隐性乳腺炎主要致病菌金黄色葡萄球菌的分子流行病学调查用PCR方法对临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌124株，隐性乳腺炎金黄色葡萄球菌213株，山羊临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌12株进行超抗原毒素sea,seb,sec,sed.See和tst基因的分子调查，结果表明：奶牛临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素基因和tst基因的阳性率为27.42％，隐性乳腺炎肠毒素基因的阳性率为1.41％，山羊临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素基因的阳性率为33.3％。奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌产生毒素的类型以SEA,TSST-1和SEC为主，山羊乳腺炎金黄色葡萄球菌产生肠毒素的类型以SEC为主。对于肠毒素基因和tst基因PCR阳性的金黄色葡萄球菌同时用ELISA和RPLA两种方法进行检测，3种检测方法基本一致，但并不完全吻合，本实验中1株sea基因阳性的金黄色葡萄球菌和4株tst基因阳性的金黄色葡萄球菌用ELISA和RPLA方法检测为SEA和TSST-1阴性。 通过对引起奶牛临床型和隐性乳腺炎的337株金黄色葡萄球菌进行Fnbp蛋白基因和Cnap基因分子调查，Fnbp蛋白基因携带率(51.04％)比Cnap蛋白基因(30.86％)高(P＜0.01)，且临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌Fnbp基因和Cnap基因携带率较隐性乳腺炎高(P＜0.01)。 4.奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌Fnbp蛋白基因的克隆、表达及其免疫原性研究选取分离菌株10A扩增出的Fnbp基因，通过引入BamHI和XhoI酶切位点，定向插入到融合表达载体PET-32a中，构建了重组质粒PET-Fnbp,并转化到宿主菌BL21(DE3)株中，IPTG诱导4h后，SDS-PAGE电泳表明，重组蛋白得到高效表达，重组蛋白主要以分泌形式存在，分子量35KDa左右，Ni柱纯化后的蛋白经Westernblotting检测，具有良好的抗原性和特异性。 对重组菌PET-Fnbp进行诱导培养后，破碎菌体，Ni柱纯化蛋白，SDS-PAGE表明获得高纯度的Fnbp蛋白，BCA法蛋白定量为2.8mg/ml，将蛋白冻干制成成品用于动物免疫，选取3头泌乳期奶牛(0288，0368，0314)进行5mg/头/次的剂量免疫，11天后二次免疫，2头奶牛(0455，0513)作为对照组，结果表明，第一次免疫注射后，只有0288号牛出现体温升高和奶产量下降外，其它牛正常，3头实验牛在30-40d，ELISA检测血清抗体滴度达到高峰，最高抗体滴度达到2-6，表明该蛋白表现出很好的抗原性。 5.隐性乳腺炎NAGase与不同病原菌、SCC、LDH、ALP、ACP之间的关系探讨对330个乳样分别用CMT，体细胞计数和细菌的分离培养法进行隐性乳腺炎的检测，结果表明3种方法检测的结果差异不显著(P＞0.05)。对分离出优势细菌的部分乳样进行了SCC与LDH，NAGase，ALP和ACP几种酶的测定和相关性分析，结果表明：LDH与SCC的有显著的相关性(r=0.7936)，并且LDH与NAGase、ALP和ACP都有明显的相关性；NAGase与ACP、LDH有明显的相关性，但与ALP没有相关性；ALP只与ACP和LDH有显著的相关性外，与SCC，NAGase没有相关性；ACP与SCC，LDH，NAGase，ALP都有极显著的相关性。 6.不同类型乳腺炎奶牛乳腺的病理组织学观察及肥大细胞计数分析对于金黄色葡萄球菌引起的1例临床型乳腺炎和2例隐性乳腺炎的乳腺组织进行了病理组织学观察和肥大细胞的计数比较，结果表明：金黄色葡萄球菌引起的化脓性乳腺炎乳腺实质遭到严重破坏，在乳腺腺泡内可见到脓肿，腺泡变小，伴随大量的结缔组织增生，乳腺腺泡周围和表面有炎性细胞存在；金黄色葡萄球菌引起的隐性乳腺炎以乳腺组织出现不同程度的渗出性变化为特点，乳导管内有大量炎性细胞和上皮细胞；乳腺炎奶牛乳腺组织腺泡中有一定程度的肥大细胞浸润。主要分布在相邻腺泡周围、乳导管上皮周围，呈圆形或椭圆形，大小不一，胞核小而圆，多位于中央；乳腺炎乳腺组织内的肥大细胞数目较健康乳腺多，差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。 7.奶牛临床型乳腺炎的治疗对临床型乳腺炎274例的治疗实验表明：复方丁胺卡那与5％头孢喹诺乳剂具有很好的临床治愈率，分别为85％和82.14％，两者差异不显著(P＞0.05)；普鲁卡因青霉素乳剂与2％蒽诺沙星的治疗效果次之，青链霉素的治疗结果最差。通过对顽固性乳腺炎的治疗发现，红花注射液以及外用消炎膏与自拟中药方剂以及外用消炎膏2种治疗方法的临床治愈率差异不显著(P＞0.05)，治愈率为45.83％-50％。

目录

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符号说明

第一章前言

第二章奶牛乳腺炎的病原菌的分离、鉴定和菌群分析

第三章奶牛隐性乳腺炎诊断方法的研究

第四章奶牛临床型乳腺炎的治疗实验

第五章多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌，无乳链球菌，停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用

第六章乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素和毒素休克综合征毒素-1的调查研究

第七章奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌Fnbp和Cnap基因的调查及Fnbp基因的克隆与原核表达

第八章金黄色葡萄球菌Fnbp的纯化以及疫苗的田间免疫实验

第九章金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺组织以及肥大细胞数量的影响

第十章结论

参考文献

附录

博士期间发表文章情况

致谢