鸡免疫抑制性病毒的PCR检测方法优化及分子流行病学调查

摘要

鸡群中常见免疫抑制性病毒主要有5种，分别是IBDV、MDV、ALV、REV及CIAV：除上述5种病毒外，某些毒株的呼肠孤病毒(Reovirus)、新城疫病毒、传染性喉气管炎病病毒等也可以造成免疫抑制(Immunosuppressive)。这些病毒除不同程度的引起机体发生原发感染甚至死亡之外，更严重的是以亚临床感染的形式出现，致使感染禽的免疫系统受到损害，引起机体免疫功能下降，导致疫苗免疫效果降低、并发或继发感染其它病原。根据近年的报道，这几种免疫抑制病在我国鸡群中存在较为普遍，且常常出现多重感染，给养鸡业造成了巨大的经济损失。 针对免疫抑制性病毒在我国部分地区广泛流行，且往往呈现混合感染的特点，传统的从病料中直接分离病毒和血清学方法都很难满足临床诊断和做大规模流行病学调查的需要。目前单重PCR、多重PCR已经应用于这几种病毒的诊断，并且取得了较好效果。为了更好的应用PCR方法检测免疫抑制性病毒，本研究对目前使用的：PCR检测方法进行了优化，并用优化后PCR检测方法对山东主要养禽地区不同鸡群的鸡只进行了免疫抑制性病毒的调查，进一步了解了几种主要免疫抑制性疾病在山东的流行特点。针对山东某规模化种鸡场的某些分厂出现的不同日龄种鸡及所产商品肉鸡NDV免疫后抗体水平明显偏低，并且所产商品鸡饲养到30日龄左右时生长缓慢、大肠杆菌、球虫及新城疫病毒等感染率明显升高，对该种鸡场的不同日龄种鸡及商品鸡进行了免疫抑制病毒检测和NDV抗体水平的检测，表明免疫抑制性病毒的感染对该鸡场的发病起了重要的作用。 本研究分2个部分： 1．鸡免疫抑制病毒PCR检测方法的优化及应用`为进一步优化免疫抑制性疾病PCR检测方法，在确保与MDV、REV、ALV及CIAV的PCR检测方法反应程序一样的条件下，参照已发表IBDV毒株序列，在结构蛋白VP2编码基因的高变区(VP2 variable domain,vVP2)两端外侧的保守序列内设计合成了2对寡核苷酸引物，对包括疫苗株在内的10株参考毒株进行逆转录酶一聚合酶链式反应(RT-PCR)检测。结果10个参考毒株均能扩增出约492bp的目的片段，而对作为阴性对照的常见5种鸡病病原NDV、IBV、CIAV、B．avium、E．coli均没有扩增出任何片段；同时经临床检验、序列分析表明，该检测技术可用于临床病料、细胞毒及鸡胚毒的检测。优化后的PCR．检测技术能同时一次性检测5种病原，大大方便了临床病例的检测和大规模流行病学调查。运用优化后的PCR检测方法，对来自山东主要养禽地区收集、送检的18个鸡群278羽鸡进行免疫抑制性病毒的检测。结果五中免疫抑制病毒的感染率分别为CIAV(46.04％)、MDV(14.03％)、IBDV(12.95％)、REV(2.51％)及ALV(2.16％)，其中被检鸡混合感染的总阳性率为21.58％。 2．山东某规模化鸡场免疫抑制性病毒分子流行病学调查及鸡群ND疫苗免疫效果分析为了解AA肉种鸡群中免疫抑制性病毒的存在状况及其对NDV疫苗免疫效果和对商品鸡生长的影响，采用多重PCR、RT-PCR和血清学方法对山东某规模化大型AA父母代肉种鸡场的28日龄、180日龄左右种鸡及其所生产的1日龄、30日龄左右商品鸡进行IBDV、MDV、ALV、REV、CIAV及REOV感染状况调查，并同时对鸡群NDV免疫后抗体水平进行跟踪监测，结果表明种鸡和商品鸡均存在CIAV的感染，并不同程度的存在CIAV与MDV、IBDV等共感染；发病鸡群NDV抗体水平明显偏低的原因是由于鸡群感染免疫抑制性病毒所致；种鸡群感染CIAV并垂直传播给商品鸡，间接引起了商品鸡发生免疫抑制性病毒的共感染，导致了商品鸡群30日龄左右生长受阻、免疫能力降低、疾病爆发。因此，免疫抑制性疾病是目前养鸡业的潜在威胁。

目录

论文说明：符号及缩略词

声明

摘要

前言

1.禽免疫抑制病概述

2.引起禽免疫抑制病的原因

2.1药物引起的免疫抑制

2.2营养缺乏引起的免疫抑制

2.3霉菌毒素引起的免疫抑制

2.4传染性因子引起的免疫抑制

3.免疫抑制性病毒的共感染

4分子生物学检测方法

5本课题研究的内容、目的和意义

参考文献

1.材料和方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1 RT-PCR检测方法的建立及特异性试验

2.2敏感性试验

2.3 RT-PCR检测临床病料及细胞毒结果

2.4流行野毒毒株与实验室保存毒株扩增区间内序列的同源性

2.5分子流行病学检测结果

3.小结与讨论

参考文献

试验二 AA肉鸡群中免疫抑制性病毒分子流行病学调查及对疫苗免疫效果影响分析

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1五种免疫抑制性病毒的检测结果

2.2发病鸡群病毒感染状态统计结果

2.3 REOV的血清学调查结果

2.4 NDV抗体水平检测结果

3.讨论

参考文献

结论

致谢

个人简介

攻读硕士学位期间发表的论文