猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白酶的分离提纯及特性研究

摘要

猪传染性胸膜肺炎(PorcinePleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杼菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一种常见的呼吸道传染病，各年龄的猪只均可感染。猪群感染胸膜肺炎放线杆菌后，当遇到气候环境突变，通风不良等应激因素时，猪只抵抗力下降，可诱发本瘸，主要表现为精神沉郁，体温升高，呼吸困难等临床症状，并出现特征性的出血性肺炎和胸膜炎。本病在世界各养猪国家普遍存在，近年来，流行日趋严重，成为世界规模化养猪的五大重要疫病之一，造成了巨大的经济损失。 构成APP致病性的毒力因子包括溶盘毒素(Apx)、英膜多糖(CP)、脂多糖(LPS)、外膜蛋自(OMP)、转铁结合蛋自(Tbp)、渗透因子、脲素酶(Urase)、蛋白酶(Protease)等。然而，关于细菌的增殖和组织降解的很多问题都还没有解决。蛋白酶很可能通过降解不同的宿主底物(如IgA、IgG)来促进呼吸器官粘膜表面组织的损伤，加快APP的进一步侵入。NegreteAbascalE(1994)等已分离到能分泌切割免疫球蛋白蛋白酶的APP。在本研究中我们检测了APP在体外培养时分泌的蛋白酶的一些生化特性。这些蛋白酶在宿主组织内也能分泌，且促进了组织的损伤和细菌的增殖(NegreteAbascalEeta1.，2000:NegreteAbascalEeta1.，1998)。因此，研究APP蛋白酶的生化特性，对有效预防和控制猪传染性胸膜肺炎，保护和促进养猪业的健康发展具有重要意义。 本研究共分两部分： 第一部分：猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白酶的分离、纯化及特性分析 将盘清7型猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)出东分离株接种子含0.2％NAD的LB液体培养基，37℃培养48h后，经硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换层橱、葡聚糖凝胶分子筛层析，从其培养上清液中分离纯化了一种蛋白酶。SDS-PAGE显示，APP蛋白酶含有分子量约为45kD的亚单位。以酪蛋白为底物测得该酶的最适pH值为7.5，最适温度为45℃；该酶对热有一定稳定性，80℃加热30min仍保留部分活性；乙二胺四乙酸(EDTA)可抑制其活性，而苯甲基磺酰氟(PMSF)对其无影响。 第二部分：猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白酶的免疫保护研究 将提纯的APP蛋白酶制备成亚单位油乳剂疫苗，分不同剂量(10μg/只、20μg/只、30μg/只、40μg/只、50μg/只、100μg/只和200μg/只)免疫小白鼠，然后进行同源性保护试验。结果显示蛋白酶在100μg/只以上的免疫剂量下对小白鼠产生较强的保护作用。用同源菌株攻毒后，对照组未经免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡，肺脏严重出血，肝脏肿大出血；10μg免疫组的小白鼠全部死亡，肺脏严重出血；20μg、30μg、40μg、50μg、100μg、200μg免疫组的小白鼠死亡率随免疫剂量的增加依次呈下降趋势，肺脏出血程度也依次减轻。 在最佳免疫剂量下免疫30日龄小白鼠，间隔2周加强免疫一次。每次免疫后采血检测蛋白酶的抗体，第二次免疫2周后用猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型、7型菌株进行攻毒。结果发现第二次免疫后抗体水平较高，用2种血清型进行攻毒后其保护力分别为37.5％和62.5％，并从死亡小鼠体内分离到了攻毒菌株。初步的动物试验结果表明，该蛋白酶具有一定的免疫原性及保护力，但其诱导的免疫反应对同型及异型菌株的攻击只能提供部分保护。研究表明该蛋白酶在猪传染性胸膜肺炎的免疫保护过程中起一定的作用，该研究为APP亚单位疫苗的研制及应用提供了理论依据。

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声明

引言

1.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的病原生物学特征

1.1病原特征

1.2毒力因子的分子生物学特征

2猪传染性胸膜肺炎的流行病学

3猪传染性胸膜肺炎的诊断

3.1微生物学诊断

3.2血清学诊断

3.3分子生物学诊断

4猪传染性胸膜肺炎的预防

4.1改善饲养环境

4.2加强卫生管理

4.3减少应激因素

4.4严把检疫关

4.5淘汰阳性猪只

4.6疫苗免疫

试验一 猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白酶的分离、纯化及特性分析

1.材料与方法

1.1试验菌株

1.2试剂与仪器

1.3培养基

1.4最佳产酶条件的优化

1.5APP的扩大培养

1.6蛋白酶的提取及纯化

1.7酶活力的测定

1.8蛋白含量的测定

1.9蛋白酶的检测

1.10蛋白酶的理化性质

1.11致病性试验

2.结果与分析

2.1最佳产酶条件的优化

2.2最佳硫酸铵饱和度的确定

2.3蛋白酶的提取及纯化

2.4蛋白酶的检测

2.5蛋白酶的理化性质

2.6致病性试验

3讨论

试验二猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白酶对小白鼠的免疫保护研究

1.材料与方法

1.1试验菌株

1.2试剂

1.3仪器

1.4试验动物

1.5细菌培养及计数

1.6蛋白酶亚单位油乳剂疫苗的制备

1.7免疫保护力试验

1.8抗体的检测

2结果与分析

2.1最佳免疫剂量的确定

2.2蛋白酶ELISA最佳反应条件测定的结果

2.3免疫小白鼠抗体的检测结果

2.4攻毒结果

3讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况