根霉ZM-10脂肪酶酶学性质和化学修饰

摘要

脂肪酶在酿酒工业中的应用具有十分重要的意义，大曲中的根霉（Rhizopus）是白酒发酵过程中酒体香气成分形成的主要微生物之一。浓香型白酒的风格及酒质的优劣，主要取决于酒体中己酸乙酯含量的高低以及与其它酯类物质的比例是否协调。根霉脂肪酶在酿酒生产中得以应用，但其酶学特性和催化机理未研究阐明，存在酶活较低、生香效果不稳定、增香针对性不强、应用技术条件不明确、使用范围不广等实际问题，在酿酒工业也远未得到充分应用。因此，深入研究和阐明根霉脂肪酶的酶学性质和作用机制对其在食品工业中的应用具有较大的理论和实践意义。本论文以明确根霉ZM-10脂肪酶的酶学性质和活性中心的氨基酸种类为目标，研究了根霉ZM-10脂肪酶分离纯化条件、基本酶学性质、表现酶活性所必需的氨基酸种类，主要结果和结论如下：
　　 1.根霉ZM-10脂肪酶的分离纯化：根霉ZM-10脂肪酶经过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Sephardex G-100凝胶过滤层析得脂肪酶，纯化倍数15.3倍，酶活回收率22.2％。根霉ZM-10脂肪酶分离纯化条件为：最佳硫酸铵盐析饱和度70％；DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析最佳条件：上样量5mL、流速3mL/min、每管收集3mL、洗脱体积10倍柱体积、洗脱最佳盐浓度0.4mol/L；Sephardex G-100凝胶过滤层析最佳条件：上样量3mL、流速：自然流速、每管收集1.8mL、洗脱体积：2倍柱体积。经SDS-PAGE凝胶电泳检测得该脂肪酶的分子量约为44kDa。
　　 2.根霉ZM-10脂肪酶的基本酶学性质：对纯化后根霉ZM-10脂肪酶基本酶学性质研究表明：该脂肪酶的最适反应温度35℃，最适pH为8.0。该酶在20℃下1h时仍保持90％以上的活力，在pH7.5、8.0具有较高的稳定性。Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+及EDTA对其活性影响较小，Zn2+具有显著的抑制作用。醇类有机溶剂对该脂肪酶的活性有一定的抑制作用，其在极性较小的烷烃类有机溶剂中稳定性良好。
　　 3.根霉ZM-10脂肪酶活性中心的化学修饰：采用NBS、EDC、DEPC、CH-T、PMSF、DTNB等6种化学修饰剂对根霉ZM-10脂肪酶进行化学修饰、底物保护实验，研究了其分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。实验结果表明：酸性氨基酸（天冬氨酸/谷氨酸）残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、色氨酸残基为根霉ZM-10脂肪酶活性的必需基团。酸性氨基酸（天冬氨酸/谷氨酸）残基、组氨酸残基和丝氨酸残基位于根霉ZM-10脂肪酶的活性中心部位，而色氨酸残基在保持脂肪酶活性中起到重要作用，但其不位于根霉ZM-10脂肪酶的活性中心部位；通过EDC、DEPC的修饰动力学实验表明根霉ZM-10脂肪酶分子活性中心至少包括一个天冬氨酸（或谷氨酸）残基和一个组氨酸残基。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

1 引言

1.1 中国白酒与根霉脂肪酶

1.2 产脂肪酶微生物介绍

1.3 脂肪酶的分离纯化和酶学性质

1.4 脂肪酶的结构特征

1.5 脂肪酶的化学修饰

1.6 本课题研究的目的、内容、意义

1.6.1 研究内容

1.6.2 研究目的和意义

1.7 技术路线

2 材料与方法

2.1 菌种及原料

2.2 培养基

2.3 主要试剂

2.4 主要仪器

2.5 实验方法

2.5.1 细胞内脂肪酶的制备

2.5.2 根霉脂肪酶的分离纯化

2.5.3 脂肪酶基本酶学性质的研究

2.5.4 脂肪酶活性中心氨基酸的化学修饰

2.5.5 EDC、DEPC对根霉ZM-10脂肪酶的修饰动力学

2.6 分析方法

2.6.1 脂肪酶活性的测定

2.6.2 蛋白质浓度的测定

2.6.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

3 结果与分析

3.1 根霉ZM-10脂肪酶的分离纯化

3.1.1 硫酸铵饱和度对盐析效果的影响

3.1.2 DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析分离纯化条件的确定

3.1.3 Sephardex G-100凝胶过滤层析分离纯化条件的确定

3.1.4 根霉ZM-10脂肪酶相对分子质量的确定

3.1.5 根霉ZM-10脂肪酶分离纯化结果

3.1.6 小结

3.2 根霉ZM-10脂肪酶基本酶学性质的研究

3.2.1 温度对根霉ZM-10脂肪酶活性的影响

3.2.2 温度对根霉ZM-10脂肪酶稳定性的影响

3.2.3 pH对根霉ZM-10脂肪酶活性的影响

3.2.4 pH对根霉ZM-10脂肪酶稳定性的影响

3.2.5 金属离子及EDTA对根霉ZM-10脂肪酶活性的影响

3.2.6 有机溶剂对根霉ZM-10脂肪酶活性的影响

3.2.7 小结

3.3 根霉ZM-10脂肪酶活性中心氨基酸的化学修饰

3.3.1 酸性氨基酸（天冬氨酸/谷氨酸）残基的化学修饰

3.3.2 组氨酸残基的化学修饰

3.3.3 丝氨酸残基的化学修饰

3.3.4 色氨酸残基的化学修饰

3.3.5 半胱氨酸残基的化学修饰

3.3.6 蛋氨酸残基的化学修饰

3.3.7 EDC对根霉ZM-10脂肪酶活性的修饰作用动力学

3.3.8 DEPC对根霉ZM-10脂肪酶活性的修饰作用动力学

3.3.9 小结

4 讨论

4.1 脂肪酶活性测定方法的选择

4.2 根霉ZM-10脂肪酶的分离纯化

4.3 根霉ZM-10脂肪酶的基本酶学性质

4.4 根霉ZM-10脂肪酶活性中心的化学修饰

5 结论

6 参考文献

7 致谢

8 攻读硕士学位期间发表的论文情况