外源甲基紫精对盐胁迫下黄瓜叶片抗氧化酶与DNA甲基化的影响

摘要

土壤盐渍化是一个世界性的资源环境和生态问题。因此，植物耐盐性研究具有重要的意义。本实验以温室型黄瓜品种“春光2号”为材料，报告了外源甲基紫精缓解植株的盐胁迫，研究了外源甲基紫精对盐胁迫下黄瓜叶片抗氧化酶与DNA甲基化的影响，分离了盐胁迫下外源甲基紫精诱导的甲基化差异片段，然后对这些差异片段进行克隆、测序和序列的生物信息学分析。本文从抗氧化酶、整个基因组水平上初步揭示外源甲基紫精缓解盐胁迫的机制，为利用甲基化差异基因打下基础，为外源甲基紫精在黄瓜耐盐生产中的应用提供依据，并为其它外源物质缓解植物逆境胁迫的机制研究提供参考。
　　 实验在黄瓜幼苗长至两叶一心时进行，用10μM甲基紫精（PQ）浇灌黄瓜幼苗后于100μmol m-2 s-1光照下处理1 h，然后分别用水和营养液冲洗植株各6次，将黄瓜幼苗在暗处放置24 h后浇灌100mM NaCl，进行盐处理。盐胁迫处理两天后取第二片真叶，测定其超氧化物歧化酶（SOD，EC1.15.1.1）、愈创木酚过氧化物酶（GPX，EC1.11.1.7）、过氧化氢酶（CAT，EC1.11.1.6）、谷胱甘肽还原酶（GR，EC1.6.4.2）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，EC1.11.1.9）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR，EC1.8.5.1）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAK，EC1.6.5.4）和抗坏血酸过氧化物酶（APX，EC1.11.1.11）的活性，检测叶片中丙二醛（MDA）、内源H2O2、抗坏血酸（AsA）还原型谷胱甘肽（GSH）和超氧阴离子（O2-）的水平。另外，实验提取黄瓜叶片基因组DNA，利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术研究黄瓜叶片基因组DNA甲基化的水平和状态变化，对盐胁迫下甲基紫精预处理诱导的DNA甲基化差异片段进行回收，克隆和测序分析。主要结果如下：
　　 1、甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片抗氧化酶的影响
　　 盐胁迫严重抑制了黄瓜幼苗的生长，使地上部和根系干重均显著下降；PQ处理后再进行盐胁迫的黄瓜幼苗中，地上部和根系干重明显上升，PQ处理缓解了盐胁迫对黄瓜生长的抑制作用。PQ处理提高了盐胁迫下黄瓜叶片抗氧化酶SOD、GPX、CAT、APX、GSH-Px、DHAR、MDHAR和GR的活性，增加了盐胁迫下抗氧化物AsA和GSH的含量、还原型AsA与氧化型AsA比值以及GSH与GSSG的比值，同时显著降低了盐胁迫下黄瓜叶片MDA的含量、O2-生成速率以及H2O2的含量，缓解了盐胁迫下ROS对黄瓜叶片的伤害。因此，我们推断，盐胁迫下PQ处理通过提高黄瓜幼苗抗氧化酶的活性和抗氧化物的含量，降低活性氧的含量，进而缓解了盐胁迫诱导的膜脂过氧化损伤，减轻了盐胁迫对黄瓜幼苗生长的抑制，提高了黄瓜幼苗的耐盐性。
　　 2、甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片DNA甲基化的影响
　　 利用32对引物对黄瓜叶片基因组DNA甲基化进行了MSAP分析：共扩增出1324条带，对照、PQ预处理、salt处理以及PQ+salt处理的总甲基化比率分别为19.8％、19.9％、21.5％和20.4％。在盐胁迫下，黄瓜植株DNA甲基化水平发生改变；外源甲基紫精预处理黄瓜幼苗后，能诱导盐胁迫下黄瓜DNA发生去甲基化。对部分甲基化差异片段回收、克隆、测序及序列比对后，发现6条片段与植物响应逆境胁迫的基因序列具有较高的同源性。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

1 引言

1.1 研究盐胁迫的意义

1.2 盐胁迫对植物的危害

1.3 盐胁迫对植物抗氧化酶的影响

1.3.1 活性氧的产生与危害

1.3.2 植物体内的抗氧化酶

1.3.3 盐胁迫对植物体内抗氧化酶的影响

1.4 盐胁迫对植物基因组DNA甲基化的影响

1.4.1 DNA甲基化的维持机制

1.4.2 植物DNA甲基化的生物学功能

1.4.3 DNA甲基化的研究方法

1.4.4 盐胁迫对基因组DNA甲基化的影响

1.5 外源甲基紫精提高植物抗逆性的研究进展

1.6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.2.1 叶片抗氧化酶活性及相关指标的测定

2.2.2 叶片抗氧化酶活性及相关指标的统计分析

2.2.3 基因组DNA的提取与纯化

2.2.4 甲基化敏感扩增多态性分析

3 结果与分析

3.1 甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片抗氧化酶的影响

3.1.1 甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片SOD活性的影响

3.1.2 甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片CAT、GPX、GSH-Px和APX活性的影响

3.1.3 甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片DHAR、MDHAR和GR活性的影响

3.1.4 甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片抗氧化酶相关指标的影响

3.2 甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜DNA甲基化的影响

3.2.1 基因组DNA的提取与纯化

3.2.2 限制性酶切与连接

3.2.3 选择性扩增

3.2.4 甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片DNA甲基化水平的影响

3.2.5 甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片DNA甲基化状态的影响

3.2.6 差异片段的回收与克隆

3.2.7 差异片段序列分析

4 讨论

4.1 甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片抗氧化酶的影响

4.2 甲基紫精预处理对盐胁迫下黄瓜叶片DNA甲基化的影响

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况