外源过氧化氢对干旱胁迫下两种生态型黄瓜叶片抗氧化酶与DNA甲基化的影响

摘要

以黄瓜华北生态型品种“津春四号”和华南生态型品种“绿丰六号”幼苗为材料，报告外源过氧化氢（H2O2）缓解植株的干旱胁迫，研究干旱胁迫下外源H2O2对黄瓜叶片抗氧化酶和基因组DNA甲基化的影响，分离干旱胁迫下外源H2O2诱导的甲基化差异片段，然后对这些差异片段进行克隆、测序和序列的生物信息学分析。课题从抗氧化酶、整个基因组水平上初步揭示外源H2O2缓解干旱胁迫的机制，为甲基化差异基因的利用打下基础，为外源H2O2在黄瓜抗旱生产中的应用提供依据，并为其它外源物质缓解植物逆境胁迫的机制研究提供参考。
　　 待幼苗长至两叶一心时，对两个品种的黄瓜幼苗喷施1.5 mM的H2O2，8 h后浇灌10％聚乙二醇（PEG），进行干旱处理。对各组植株处理60 h后，取第二片真叶进行透射电子显微镜观察、测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、愈创木酚过氧化物酶（GPX）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR）等抗氧化酶的活性以及丙二醛（MDA）、内源H2O2、抗坏血酸（AsA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和超氧阴离子（O2-）的水平，同时，采用甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）分析DNA甲基化变化情况，对干旱胁迫下H2O2预处理诱导的DNA甲基化差异片段进行回收，克隆和测序分析。主要结果如下：
　　 1、干旱胁迫下外源H2O2对黄瓜叶片抗氧化酶的影响
　　 PEG模拟的干旱胁迫下，两个生态型黄瓜品种的第二片真叶大部分都发生了萎蔫现象；当用H2O2预处理后再进行PEG处理时，大部分的黄瓜叶片生长状况正常。在10％PEG模拟的干旱胁迫下，叶绿体肿胀变圆，其膜和类囊体模糊不清，部分叶细胞中线粒体膜开始溶解，变得模糊，线粒体脊开始分解破裂；而干旱胁迫下外源H2O2预处理的叶片中，叶绿体结构正常，线粒体膜都相对比较完整。PEG模拟的干旱胁迫使幼苗叶片的MDA和内源H2O2含量以及O2-的产生速率高于对照。和干旱胁迫相比，利用外源H2O2预处理后再进行干旱胁迫时增强了叶片的SOD、CAT、GPX、APX、MDHAR、DHAR和GR等抗氧化酶的活性，提高了非酶抗氧化物AsA和GSH的含量，因而降低了叶片的内源H2O2含量、O2-的产生速率和MDA的含量。所以，外源H2O2预处理提高了黄瓜叶片抗氧化酶的活性，进而减轻了干旱胁迫对叶片超微结构膜系统的伤害。
　　 2、干旱胁迫下外源H2O2对黄瓜叶片DNA甲基化的影响
　　 MSAP分析结果显示，在干旱胁迫下，黄瓜植株DNA甲基化水平发生明显改变；外源H2O2预处理黄瓜幼苗后，能诱导黄瓜DNA发生去甲基化。干旱胁迫下黄瓜幼苗基因纽DNA的甲基化变化趋势与叶片形态变化、超微结构变化和抗氧化酶的变化趋势一致。对DNA甲基化差异片段进行序列分析后发现，干旱胁迫和H2O2预处理诱导的DNA甲基化主要分布在基因编码区，说明黄瓜植株在基因组范围内调控基因的表达以应对外界干旱胁迫和H2O2预处理。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

1 引言

1.1 研究干旱胁迫的意义

1.2 干旱胁迫对植物形态结构的影响

1.3 干旱胁迫对植物体内抗氧化酶的影响

1.3.1 活性氧的产生与危害

1.3.2 干旱胁迫对抗氧化酶的影响

1.4 干早胁迫对植物基因组DNA甲基化的影响

1.4.1 DNA甲基化的机制

1.4.2 DNA甲基化的作用

1.4.3 DNA甲基化的检测方法

1.4.4 干旱胁迫对DNA甲基化的影响

1.5 外源H2O2预处理减缓逆境胁迫的研究进展

1.6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.2.1 抗氧化酶活性的测定

2.2.2 抗氧化酶相关指标的测定

2.2.3 抗氧化酶及其相关指标的统计分析

2.2.4 黄瓜基因组DNA的提取与纯化

2.2.5 甲基化敏感扩增片段长度多态性（MSAP）分析

2.2.6 MSAP差异片段的回收、克隆及测序

3 结果与分析

3.1 干旱胁迫下外源H2O2对黄瓜叶片形态的影响

3.2干旱胁迫下外源H2O2对黄瓜叶片抗氧化酶活性的影响

3.3 干旱胁迫下外源H2O2对黄瓜叶片抗氧化酶相关指标的影响

3.4 MSAP结果分析

3.4.1 基因组DNA的提取和纯化

3.4.2 DNA酶切和PCR扩增

3.4.3 干旱胁迫下外源H2O2对黄瓜叶片DNA甲基化水平的影响

3.4.4 干旱胁迫下外源H2O2对黄瓜叶片DNA甲基化状态的影响

3.4.5 差异片段的回收、测序及序列分析结果

4 讨论

4.1 干旱胁迫下外源H2O2对黄瓜叶片抗氧化酶的影响

4.2 干旱胁迫下外源H2O2对黄瓜叶片DNA甲基化的影响

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况