用于多模态分子影像含双报告基因的腺病毒载体的构建及鉴定

摘要

目的：构建含有由人转铁蛋白受体基因(TFRC)和萤火虫荧光素酶基因(Luc)组成的双报告基因的重组腺病毒载体(Ad),为磁共振(MR)和生物发光双模态分子成像提供一个全新的实验工具。
　　方法：从psiCHECK-2质粒中用聚合酶链式反应(PCR)扩增Luc基因,克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV后行NheⅠ/XbaⅠ双酶切和测序鉴定。然后利用PCR扩增TFRC基因,克隆到pShuttle-CMV-CMV-Luc穿梭载体的多克隆位点区,进行SfiⅠ酶切和测序鉴定,得到的重组穿梭载体pShuttle-TFRC-Luc再与腺病毒骨架载体(pAdeno)同源重组,然后将XhoⅠ酶切鉴定正确的重组病毒质粒经293细胞包装纯化并行PCR鉴定,测定其病毒滴度。用获得的重组腺病毒Ad-TFRC-Luc感染人结直肠癌LOVO细胞,转铁蛋白受体(TfR)和荧光素酶蛋白的表达分别用免疫蛋白印迹(western blot)、实时荧光定量PCR法和体外生物发光成像来检测。
　　结果：转铁蛋白受体基因正确重组到携带有荧光素酶基因的腺病毒载体中,测序结果与GenBank序列完全一致,酶切鉴定结果显示均能得到与理论大小相符的2.3kb片段。Ad-TFRC-Luc重组腺病毒构建成功,病毒滴度达1.6×1010pfu/ml,感染LOVO细胞48小时后转铁蛋白受体和荧光素酶蛋白的表达水平显著增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。
　　结论：Ad-TFRC-Luc重组腺病毒构建成功,可用于下一步的多模态活体成像示踪肿瘤生长、基因治疗以及移植干细胞。

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前 言

材料与方法

1 主要材料

2 实验仪器

3 实验方法

4 统计方法

结 果

1 PCR扩增luciferase基因

2 重组穿梭载体pShuttle-Luc的酶切与测序鉴定

3 TFRC基因的扩增

4 pShuttle-TFRC-Luc重组穿梭质粒的酶切鉴定和测序

5 重组pAdeno-TFRC-Luc腺病毒质粒的鉴定

6 重组腺病毒Ad-TFRC-Luc的滴度测定

7 重组腺病毒Ad-TFRC-Luc的PCR鉴定

8 体外生物发光成像LOVO细胞荧光素酶的表达

9 体外LOVO细胞中转铁蛋白受体蛋白的表达

10 体外LOVO细胞中转铁蛋白受体基因（TFRC）的表达

讨 论

结 论

附 图

参考文献

综 述