猪CuZnSOD基因的克隆、mRNA表达及其对肉质抗氧化性能的影响

摘要

随着现代饲养业集约化程度的不断提高，氧化在商品猪生产中的危害已大量显现，可负面影响活体动物的免疫机能和宰后肉质特性等。抗氧化酶可缓解或者抑制自由基的负面效应，提高商品猪的抗氧化能力,进而改善商品猪的肉质。CuZnSOD(Copper ZincSuperoxide Dismutase)是超氧化物歧化酶(SODs)家族的成员之一，是集体防御氧化损伤的一种重要的金属酶，能转移性地清除超氧阴离子自由基，在维持氧自由基平衡方面起着重要的作用。
　　 为了进一步了解和认识CuZnSOD基因的结构和功能，揭示CuZnSOD 对猪抗氧化机能的影响，寻找与肉质性状相关联的分子标记。本研究采用RACE(Rapid Amplificationof cDNA End)和Genome Walking的方法，对莱芜猪CuZnSOD基因cDNA和启动子区域进行克隆测序，分析基因结构和功能，并构建能在细胞中表达的真核表达载体。用QRT-PCR 检测CuZnSOD基因的品种和组织差异表达，研究其表达对肉质性状和肉质抗氧化的影响。本研究主要分以下三个部分：
　　 1.CuZnSOD基因cDNA序列全长658 bp(GenBank 登录号：GU944822)，包含76 bp的5′ UTR和120 bp的3′ UTR序列。全部CDS序列462 bp，编码153个氨基酸，分子量为15.9 kDa，等电点PI 为6.03。采用Genome Walking 试剂盒扩增基因组的启动子序列，扩增得到1876bp的片段。CuZnSOD基因编码的氨基酸序列中，第3 氨基酸残基处存在1个O-糖基化位点，第86 氨基酸残基处存在1个N-糖基化位点。二级结构中α螺旋仅占1.31％。在进化过程中高度保守，与人、牛、小鼠和大鼠的编码区同源性分别为87.74％、87.66％、83.44％和83.23％；氨基酸序列同源性分别为90.26％、94.12％、92.21％和91.50％。基于蛋白序列所构建的分子进化树，表明猪与牛的亲缘关系最近。
　　 2.采用RT-PCR 方法，以莱芜猪肌肉总RNA 为模板扩增CuZnSOD基因的全长cDNA 编码区序列，采用TA 克隆技术，将目的片段插入到pUCm-T 载体中进行鉴定，重组的质粒命名为pUCm-T-CuZnSOD。随后将CuZnSOD 进一步克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中。用脂质体将经过测序、验证的重组pcDNA3.1(+)/CuZnSOD 质粒转染到山羊毛囊外根鞘细胞中，用QRT-PCR 检测CuZnSOD基因mRNA的表达。结果：成功构建了pcDNA3.1(+)/CuZnSOD 真核表达质粒，转染山羊毛囊外根鞘细胞，QRT-PCR检测结果表明，所转染的CuZnSOD 在山羊毛囊外根鞘细胞中成功表达。成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/CuZnSOD，为进一步研究CuZnSOD 在肉质抗氧化的作用中奠定了基础。
　　 3.在mRNA 水平上，CuZnSOD是一个广谱表达基因，在大脑、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺、大肠、小肠、脊髓、肌肉、背膘和胃中都能检测到，同一个品种内CuZnSOD基因mRNA的表达存在明显的组织差异（P<0.05），其在肾脏、小肠和肺中表达量较高，在心脏和肌肉组织中表达量较低。在肌肉、背膘和肝脏三种组织中CuZnSOD基因mRNA的表达存在明显的品种差异（P<0.05），并且CuZnSOD基因mRNA的表达始终是莱芜猪＞鲁莱黑猪＞大约克夏猪。CuZnSOD mRNA表达越高，SOD活性越高，MDA 含量越低，肌肉的系水力越高、肉色越鲜艳，并且肉质越细嫩。

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1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

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