食源性致病菌快速检测方法的建立及其试剂盒的研制与应用

摘要

食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主要因素。近年来，食品安全事件频发，不仅影响到人们的生活、工作和健康，更是关系到国计民生的大事。随着经济的发展和人们生活水平的提高，食品安全问题越来越受到重视。我国流行的食源性疾病中，细菌性食物中毒居首位，因此，食品中食源性致病菌检测是食品卫生安全检测中一个重要的部分。常见的食源性致病菌包括沙门氏菌、致病性大肠杆菌、弯曲杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、蜡样芽胞杆菌、产气荚膜梭菌、变形杆菌属、阪崎肠杆菌、李斯特菌、结肠炎耶尔森氏菌、志贺氏菌等。面对日益增加的多重混合污染，目前的检测方法显得滞后，因此建立快速、高效、准确的食源性致病菌的检测方法已成当务之急。
　　 多重PCR是在同一PCR反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。克服了常规PCR方法单一、费时、繁琐等缺点，从而实现了多种食源性致病菌的快速同时检测，多重PCR检测方法有着更为广阔的发展空间。
　　 本研究针对空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)6种食源性致病菌建立了多重PCR快速检测方法。分别根据空肠弯曲杆菌的马尿酸酶hipO基因、副溶血弧菌的不耐热溶血毒素tlh基因、小肠结肠炎耶尔森菌的粘附侵袭位点Ail基因以及阪崎肠杆菌的16S核糖体16SrRNA基因、产气荚膜梭菌的磷脂酶cpa基因、奇异变形杆菌的Tu延伸因子tuf基因设计6对特异性引物，PCR扩增的目的基因片段长度分别为1028bp、450bp、274bp、282bp、120bp、541bp。建立多重PCR检测方法，并研制出两套三重PCR试剂盒，实现了6种食源性致病菌的同时检测。
　　 对多重PCR反应体系中引物添加量、镁离子浓度、dNTPmixture添加量及退火温度和循环数等影响要素通过L20(55)正交试验确定最佳反应体系，确定了适宜的多重PCR反应体系和扩增程序，即优化的三重PCR反应体系为：50μL反应体系中，10×PCRBuffer5μL，Mg2+(25mM)3μL，dNTPmixture(25mM)4μL，Taq酶(5U)1μL，模板各2μL，hipO、tlh和Ail终摩尔量分别为15pmol、5pmol和7.5pmol，16SrRNA、cpa和tuf终摩尔量分别为5pmol、15pmol和5pmol，双蒸水补足至50μL；两套多重PCR试剂盒扩增循环参数为：多重PCR反应采用冷启动，94℃预变性5min；然后变性(94℃，30s)，退火(57℃，40s)，延伸(72℃，70s)，35个循环，最后72℃延伸15min。
　　 反应产物在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。对多重PCR扩增产物胶回收后连接到pMD18-T载体上转化进大肠杆菌DH5α中，阳性克隆质粒进行DNA测序，登录Genebank将测序结果进行网上blast同源性比对，从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。
　　 试验中利用人工污染的肉及乳制品，对6种食源性致病菌的特异性、灵敏度进行同时检测。其中副溶血弧菌、阪崎肠杆菌和产气荚膜梭菌的多重PCR灵敏度与单重PCR相比，低一个梯度；而其他三种致病菌与单重相比灵敏度不变。空肠弯曲杆菌的检出极限为3.0×101cfu/ml，副溶血弧菌的检出极限为6.2×101cfu/ml，小肠结肠炎耶尔森菌的检出极限为1.5×101cfu/ml；阪崎肠杆菌的检出极限为1.9×101cfu/ml，产气荚膜梭菌的检出极限为5.8×101cfu/ml，奇异变形杆菌的检出极限为2.4×101cfu/ml。
　　 应用本试验研制的两套三重试剂盒，对泰安地区食源性致病菌的流行情况进行实际样品检测。从泰安各农贸市场、家禽屠宰市场、家禽零售处、家禽交易市场等采集鸡的粪便、羽毛、新鲜鸡肉、冷冻鸡肉及其屠宰用水、屠宰用具等样品409份；从泰安某奶牛场和超市采集新鲜牛奶及奶粉样品392份。经检测，样本中85份检出空肠弯曲杆菌，阳性率20.8％，6份检出副溶血弧菌，阳性率1.5％，54份检出小肠结肠炎耶尔森菌，阳性率13.2％；1份检出阪崎肠杆菌，阳性率0.1％，48份检出产气荚膜梭菌，阳性率6.0％，48份检出奇异变形杆菌，阳性率6.0％。将多重PCR方法的检测结果与国标法进行比较，符合率为100％。
　　 由试验结果得知：本研究建立的多重PCR方法具有操作简便，检测周期短，敏感度和特异性高等优点，可在5h内得到检测结果，能同时检测上述六种病原菌。为食品及其原料的生物安全监测提供了新的、更准确的技术手段，可用于动物细菌性疾病的临床诊断。