猪PCV2 ORF2蛋白表达与I-ELISA检测方法的建立及猪场血清抗体检测分析

摘要

猪圆环病毒2型(porcine circovirus2，PCV2)作为断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的病原，它不但能够导致断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与猪发生的多种疾病密切关联。猪感染PCV2后，机体会处于免疫抑制状态，进而引起其他各种疾病病原的继发感染，由PCV2造成的间接生产损失难以估量。PCV2在当前已经成为严重阻碍养猪业健康发展的主要病原之一。目前，还缺乏一种适于大规模诊断和检测PCV2的可靠方法，因为PCV1在目前猪群中的感染相当普遍，并且PCV1与PCV2的核苷酸同源性非常高，在检测中易出现抗原交叉的现象。而临床用PCV2ORF2的表达产物来建立ELISA检测方法，就能够实现既有效区分PCV1和PCV2，又可以进行大规模化样本检测。
　　 本研究将截短的PCV2ORF2基因进行克隆，通过酶切反应连接于原核表达载体pGEX-4T-1中，在IPTG的作用下于感受态细胞E.coli BL21(DE3)以包涵体的形式得到表达，获得31KDa左右的蛋白。通过Western-Blot鉴定该表达蛋白为目的蛋白。原核表达蛋白使用GE Healthcare Histrap进行蛋白亲和层析纯化，利用该纯化蛋白为包被抗原，以抗PCV2阳性血清为一抗，羊抗猪酶标物为二抗，通过预试验确定诱导温度、诱导时间、摇动转速、IPTG浓度以及反应板种类等参数，从而建立间接酶联免疫吸附方法(I-ELISA)以检测抗PCV2猪血清抗体滴度。
　　 采用本研究建立的ELISA方法，我们测定了山东省内四个猪场送检的316份猪血清，获得每份血清中抗PCV2ORF2对应蛋白的抗体效价。分析试验数据可知，四个送检猪场血清样品的PCV2抗体阳性率均较高，其中4号场达到98％的阳性，其他三个场也在50％以上，全部血清的阳性率为74.45％(235/316)，由此可见，四个地区送检猪血清的PCV2阳性率处于较高水平。据初步统计，这些地区送检猪场极少免疫接种PCV2疫苗，而猪体抗PCV2抗体水平较高，表明猪群携带病毒的比例是很高的，故加强猪场的PCV2疫情监控、及时按计划进行疫苗接种是十分必要和紧迫的。
　　 结果表明，本试验建立的间接ELISA检测方法敏感度高、特异性强，可用于临床PCV2血清抗体的检测。这为ELISA诊断试剂盒的研制开发奠定了基础，为建立规模化猪场PCV2感染的快速诊断方法提供了科学依据。

目录

声明

主要英文缩写对照表

摘要

引言

1．发病历史回顾

2．病原学

2．1 病原类属

2．2 病毒结构特点和生物学特性

2．3 病毒的增殖特性

3．流行病学

3．1 PCV的宿主

3．2 PCV的传播途径

3．3 PCV的传播特点

4．致病机制及相关疾病

4．1 致病机制

4．2 PCV相关疾病

5．分子生物学

5．1 基因组结构

5．2 结构蛋白

5．3 病毒的变异

6．免疫学

6．1 免疫学机制

6．2 免疫抑制机制

7．检测方法现状

7．1 病毒分离

7．2 电镜法

7．3 PCR法

7．4 免疫组织化学检测技术

7．5 免疫荧光技术

7．6 原位杂交方法

7．7 酶联免疫吸附实验(ELISA)

试验一 PCV2-ORF2基因克隆与蛋白的表达与鉴定

1．材料与方法

1．1 材料及仪器设备

1．2 试剂的配制及方法建立

2．结果

2．1 重组表达质粒的PCR及酶切鉴定

2．2 目的基因的诱导表达

2．3 原核表达蛋白的Western-Blot鉴定

3．讨论与小结

试验二 抗PCV2-ORF2蛋白检测猪血清间接酶联免疫方法(I-ELISA)的建立

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 试剂及配制

1．3 间接ELISA试验参数的优化

2．结果

2．1 抗原最佳包被量和血清最佳稀释度的确定

2．2 包被液的确定

2．3 抗原包被条件的确定

2．4 血清最佳反应时间的确定

2．5 底物最佳反应时间的确定

2．6 猪血清PCV2阳性、阴性临界值的确定

2．7 间接ELISA的特异性和重复性试验

3．讨论与小结

试验三 间接酶联免疫吸附实验(I-ELISA)检测猪血清抗PCV2抗体

1．材料与方法

1．1 主要仪器设备

1．2 试剂及配制

1．3 猪血清

1．4 试验步骤

2．结果

3．讨论与小结

结论

参考文献

致谢

作者简介