猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立和嵌合型PCV1-2活病毒疫苗及其灭活制剂对PCV2低母源抗体猪的免疫保护研究

摘要

猪圆环病毒2型(porcine circovirus2，PCV2)与猪群中发生的多种传染病相关，它已被证明是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemicwasting syndrome，PMWS)等疾病的重要病原体。自1991年在加拿大断奶仔猪群中首次发现PMWS以来，世界上许多养猪国家和地区均已报道了该病的发生和流行。该病的主要临床症状是消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大、皮肤苍白及黄疸。 目前国内外学者都在致力于有效控制和消灭PCV2流行的有效疫苗的研制并已取得了一定地进展，有些疫苗已经进入临床试验和综合评价中。本研究旨在用本实验室构建的嵌合型猪圆环病毒PCV1-2活病毒及其灭活制剂作为免疫原免疫PCV2低母源抗体猪，对免疫后猪体的各项指标进行综合评价，以客观评价该候选疫苗株用于PCV2感染疾病预防的有效性，同时还对该疫苗与猪瘟疫苗的免疫相关性作一探讨，为使该候选疫苗株能够进入商品化奠定基础。与此同时，为了配合疫苗研究，为之提供必需的病毒核酸检测方法，本文还建立了SYBRGreen I荧光定量PCR方法来检测PCV2病毒核酸，该法对于临床流行病学调查、临床病例的早期诊断和疫苗免疫效果评价都有一定的帮助。 第一章猪圆环病毒2型SYBR green I荧光定量PCR检测方法的建立 参照文献设计一对PCR引物(MCV1和MCV2)，这对引物可以从含有PCV1和PCV2的样品中扩增出243 bp的条带。该对引物针对的区域位于所有已知PCV1和PCV2毒株的保守区，通过PCR扩增的产物用特异的限制性内切酶NcoI来进行消化，所有的PCV2毒株都含有这个酶切位点，而PCV1没有。消化后的PCR产物电泳鉴定结果显示，PCV2扩增产物产生168bp和75bp两个片段，而PCV1扩增产物只产生了未消化的243 bp的片段，由此可见，可用MCV片段来鉴别PCV1和PCV2。本研究用PCR方法克隆PCV2-MCV基因片段，并构建重组质粒Teasy-PCV2-MCV。将构建的重组质粒Teasy-PCV2-MCV进行酶切及测序鉴定，鉴定正确后作为PCV2 SYBR Green I荧光定量PCR(FQ-PCR)检测的标准阳性模板，通过条件优化，以5倍倍比稀释质粒Teasy-PCV2-MCV的5个稀释度为标准品，进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线，建立了PCV2核酸的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达40个拷贝，线性范围为2×109～40，达9个数量级。经特异性鉴定，此方法不与猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等阳性模板发生交叉反应，具有良好的特异性。对3个起始浓度为3×106、6×105、1×105拷贝/μL的Teasy-PCV2-MCV重组质粒为模板进行5次重复测定，最终实际测得值分别为2.983×106、5.942×105、0.987×105拷贝/μL，说明此方法具有良好的准确性和重复性。本实验建立的PCV2核酸荧光定量PCR检测方法为今后猪圆环病毒病的早期诊断和疫苗免疫效果的评价提供了可供选择的方法。 第二章嵌合型PCV1-2活病毒疫苗对PCV2低母源抗体猪的免疫保护研究 应用本实验室构建的嵌合型猪圆环病毒PCV1-2活病毒为免疫原免疫母源抗体荧光效价在1:10～1:100间的商品猪。将12头猪随机分为两组，即PCV1-2活病毒组和攻毒对照组，各组均为6头猪。第1组肌肉注射免疫PCV1-2活病毒为103.5TCID50/头，第2组不免疫作为攻毒对照组，PCV1-2活病毒组在免疫后42天产生了较高水平的PCV2抗体，此时所有试验猪攻毒PCV2，剂量为2×104.5 TCID50/头。攻毒后21天，扑杀所有试验猪，采集血清及支气管淋巴结等相关脏器，经SYBRGreen I荧光定量PCR、病理组织学及免疫组化检测结果表明，攻毒对照组猪淋巴结比免疫组猪显著肿大，免疫组猪支气管淋巴结中PCV2病毒载量显著低于攻毒对照组，攻毒对照组猪淋巴结中PCV2抗原含量高于免疫组。上述结果表明，嵌合型猪圆环病毒PCV1-2活病毒肌肉注射免疫商品猪后，对PCV2感染能产生保护性免疫应答，有可能成为候选疫苗。 第三章嵌合型PCV1-2灭活制剂对PCV2低母源抗体猪的免疫保护研究 应用本实验室构建的嵌合型PCV1-2的灭活制剂和PCV2灭活制剂为免疫原免疫母源抗体荧光效价在1:10～1:100间的商品猪。将22头猪随机分为5组，试验组每组5头猪，健康对照组2头，第1组肌肉注射免疫PCV1-2灭活制剂8×103.5TCID50/头，第2组肌肉注射免疫PCV1-2灭活制剂6×103.5 TCID50/头，第3组肌肉注射免疫PCV2灭活制剂6×103.5 TCID50/头，第4组不免疫作为攻毒对照组，第5组为健康对照组，免疫组猪35日龄首次免疫，首免14 d后二次免疫，二免后14 d除健康对照猪外所有试验猪攻毒PCV2，剂量为2×104.5 TCID50/头(2/3滴鼻，1/3肌肉注射)。攻毒后21天，扑杀所有试验猪，采集血清及支气管淋巴结等相关脏器，SYBR Green I荧光定量PCR和病理组织学检测结果表明，攻毒对照组猪各脏器的病变程度比各免疫组猪严重，免疫组多数猪血清、支气管淋巴结中PCV2病毒载量显著低于攻毒对照组。同时综合多项免疫评价指标可知PCV1-2(6×103.5TCID50)免疫组和PCV2(6×103.5 TCID50)免疫组对试验猪的免疫保护效果优于PCV1-2(8×103.5 TCID50)免疫组，上述结果表明，嵌合型PCV1-2灭活制剂和PCV2灭活制剂肌肉注射免疫商品猪后，对PCV2感染能产生保护性免疫应答，并适合免疫剂量为6×103.5 TCID50/头。 第四章嵌合型猪圆环病毒PCV1-2活疫苗对猪瘟疫苗免疫效果的影响研究 用本室嵌合型PCV1-2活病毒对猪瘟细胞苗和睥淋苗在商品猪上进行免疫效果影响的研究，免疫后定期采集血清进行猪瘟抗体的测定，结果为免疫嵌合型PCV1-2活病毒和猪瘟细胞苗组与只免疫猪瘟细胞组相比，产生猪瘟抗体的滴度没有差异；免疫嵌合型PCV1-2活病毒和猪瘟睥淋苗组与只免疫猪瘟睥淋苗组相比，产生猪瘟抗体的滴度也没有差异，结果表明，本室嵌合型PCV1-2活病毒疫苗对猪瘟疫苗的抗体产生无影响。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

第一章 猪圆环病毒2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二章 嵌合型PCV1-2活病毒疫苗对PCV2低母源抗体猪的免疫保护研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三章 嵌合型猪圆环病毒PCV1-2灭活制剂对PCV2低母源抗体猪的免疫保护研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

第四章 嵌合型猪圆环病毒PCV1-2活疫苗及其灭活制剂对猪瘟疫苗的免疫效果的影响研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

全文小结

参考文献

致谢