肠炎沙门氏菌感染引起的白来航蛋鸡脾脏全基因组表达谱分析

摘要

沙门氏菌属肠杆菌科，为革兰氏染色阴性杆菌，对蛋鸡生产和食品安全造成重大影响。蛋鸡沙门氏菌病主要是由沙门氏菌引起的一种以蛋鸡出现零星死亡，产蛋率下降的慢性消耗疾病，时间一长，容易引起蛋鸡消化道功能紊乱，鸡群抗病力下降，继发感染其它疾病。一些沙门氏菌含有携带耐药因子的遗传质粒，耐药因子传递的对多种抗生素的耐药性，给治疗沙门氏菌污染造成困难。从鸡本身出发，研究其对沙门氏菌感染抗性的分子机制是缓解沙门氏菌病对蛋鸡生产危害的有效途径之一。
　　 本研究以开产蛋鸡为研究对象，用肠炎沙门氏菌感染后，采集血液，用全血自动分析仪分析肠炎沙门氏菌对血液生理指标的影响，利用Agilent鸡4*44K V2全基因组表达芯片检测感染后8天和16天脾脏组织的基因表达，筛选出由沙门氏菌感染引起表达差异的基因，并对筛选出来的差异表达基因进行聚类分析，同时利用DAVID数据库对其进行生物学功能分析。此外，我们利用QRT-PCR方法对芯片结果做了验证，同时把筛选出来的差异表达基因与免疫相关基冈进行关联分析。并把两个时间点筛选出来的差异基因进行了对比。结果显示:
　　 (1)对照组和试验组的血液样品中白细胞的数量都普遍高于正常值，但同一时间点试验组和对照组的比较差异不显著;感染后8天的试验组红细胞数量明显高于对照组，但在感染后16天这种差异未达到显著性水平。
　　 (2)为了验证芯片结果的可靠性，选择了11个差异表达基因进行QRT-PCR。对芯片数据和QRT-PCR的结果进行了相关性分析，得出相关系数为r=0.804。 QRT-PCR验证结果与芯片试验结果一致，所以本研究所获得的芯片结果是准确可靠的。
　　 (3)成功筛选出感染后8天脾脏样品中差异表达基因1371个，包括已知的和免疫相关的基因33个;感染后16天脾脏样品差异表达基因692个，其中和免疫相关的基因28个。
　　 (4)聚类分析结果显示同一时间点试验动物具有更相似的表达模式;部分和免疫相关的基因存在相似的调节功能，在聚类分析中聚在一块。
　　 (5) GO和Pathway分析结果显示，差异表达基因主要涉及细胞粘附、免疫应答、细胞增殖、内毒素信号转导、白细胞粘附、G蛋白偶联受体蛋白;细胞周期、刺激神经组织的配体、类固醇激素生物合成、细胞粘附分子、视黄醇代谢等重要的信号通路。
　　 研究结果将进一步深化对鸡沙门氏菌感染分子机制的了解，为鸡的分子抗病遗传育种提供理论基础和科学依据。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 沙门氏菌病

1．1．1 沙门氏菌的致病机理和危害

1．1．2 沙门氏菌病的临床症状及病理变化

1．1．3 沙门氏菌感染的发病机制

1．1．4 沙门氏菌的检测方法

1．2 基因芯片技术概述

1．2．1 基因芯片的基本概念

1．2．2 基因芯片的分类

1．2．3 基因芯片的应用

1．2．4 基因芯片的图像采集和处理

1．2．5 芯片数据的预处理和归一化

1．2．6 基因芯片的基因注释和功能分析

1．3 基因芯片在动物研究中的应用

1．4 鸡对沙门氏菌抗性的研究进展

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 动物试验场所及菌株来源

2．1．2 试验设计

2．1．3 基因芯片

2．1．4 常规试剂和药品及耗材

2．1．5 主要仪器

2．1．6 试验试剂及其配制

2．1．7 分析工具及其网站

2．2 试验方法

2．2．1 血液生理指标的检测

2．2．2 总RNA的提取

2．2．3 RNA变性琼脂糖凝胶电泳法检测RNA质量

2．2．4 双标芯片实验操作流程

2．2．5 QRT-PCR及数据分析

2．2．6 聚类分析

2．2．7 差异表达基因的GO和PATHWAY分析

3．结果与分析

3．1 血细胞计数

3．2 RNA提取

3．3 芯片数据的预处理与归一化

3．4 芯片结果分析

3．5 芯片结果验证

3．6 免疫相关基因的聚类分析

3．7 差异表达基因的GO和PATHWAY分析

3．8 不同时间点的差异表达基因分析

4 讨论

4．1 肠炎沙门氏菌对蛋鸡血液生理指标的影响

4．2 RNA的质量对芯片结果的影响

4．3 芯片结果的验证及分析

4．4 差异表达基因的GO和PATHWAY分析

4．5 肠炎沙门氏菌感染随时间的变化

4．6 免疫相关基因在抗病机理中的作用

5 结论

参考文献

致谢