白来航鸡红羽致因突变基因型鉴定及红羽粉壳蛋鸡配套系培育方法

摘要

本发明公开了一种红羽粉壳蛋鸡配套系的培育方法。本发明提供了鉴定白来航鸡红羽致因突变基因型的引物对，其由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成，该引物对根据NCBI中公布的鸡参考基因组Gallus_gallus‑4.0版本序列信息11号染色体正义链第18,288,303位脱氧核苷酸上下游核苷酸序列设计引物，通过限制性片段长度多态性检测该位点基因型，对红羽致因突变基因型纯合的白来航鸡进行扩繁，选育纯系母本，该母本与洛岛红父本杂交后代母鸡100%为红羽表型，能够满足市场需求，具有广阔推广前景。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及家禽育种技术，尤其涉及一种白来航鸡红羽致因突变基因型鉴定及红羽粉壳蛋鸡配套系培育方法。

背景技术

中国是传统美食国家，消费者对鸡蛋的需求具有明显的地域特色，因而对蛋鸡品种的需求也呈现多元化和区域化特点。随着生活水平的提升，消费者对鸡蛋的需求，不仅注重内在的品质，还关注鸡蛋的大小、蛋壳的颜色。鸡蛋需求类型可大致分为奢侈消费需求、高端消费需求、大众消费需求和蛋品加工需求。粉壳蛋鸡品种因所产鸡蛋蛋重偏小、蛋黄比例大，成为居民鸡蛋消费的“新宠”。据统计，近年来市场上粉壳鸡蛋所占比例呈持续上升趋势，达到40%。同时，鸡羽色性状一直都是国内优质鸡育种的一个重要选择指标，也是影响其经济价值的一个重要性状。由于中国的发展历史和独有的消费理念，“红羽”蛋鸡广受欢迎。在生产上发现部分白来航鸡具有羽色基因突变，其作为母本与洛岛红父本杂交可以产生红羽后代母鸡。传统育种方法采用测交的方式，依据杂交后代的羽色表型筛选携带红羽致因突变的白来航鸡，这种方法过程繁琐，需要耗费大量人力、物力和财力，并且受到扩群大小的影响准确率不能达到100%。从供给侧结构性改革，满足国民鸡蛋消费需求新动向的角度而言，利用分子检测方法鉴定羽色致因突变位点基因型，进而应用于培育红羽产粉壳鸡蛋的国产蛋鸡新配套系势十分必要。

发明内容

本发明的一个目的是提供鉴定白来航鸡红羽致因突变基因型的引物对。

本发明提供的引物对，其由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。

本发明的另一个目的是提供鉴定白来航鸡红羽致因突变基因型的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物对和限制性内切酶；

所述限制性内切酶为NruI。

上述的引物对或上述的试剂盒在鉴定待测白来航鸡的红羽致因突变基因型中的应用也是本发明保护的范围。

上述的引物对或上述的试剂盒在选育红羽致因突变纯合基因型或红羽致因突变杂合基因型的白来航鸡中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的引物对或上述的试剂盒在选育与洛岛红公鸡杂交后代母鸡为红羽的白来航鸡中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的引物对或上述的试剂盒在鉴定待测白来航鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡的红羽性状中的应用；

或上述的引物对或上述的试剂盒在红羽粉壳蛋鸡配套系的建立中的应用也是本发明保护的范围。

上述中，所述待测白来航鸡的红羽致因突变基因型包括红羽致因突变纯合型和红羽致因突变杂合型。

本发明的第3个目的是提供一种鉴定待测白来航鸡的红羽致因突变基因型的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）用上述引物对对待测鸡进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2）将所述PCR扩增产物用上述限制性内切酶酶切，得到酶切产物；

3）检测酶切产物，根据酶切产物大小鉴定待测白来航鸡的红羽致因突变基因型。

或，本发明还提供一种鉴定待测白来航鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡的红羽性状的方法，包括如下步骤：

1）用上述引物对对待测鸡进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2）将所述PCR扩增产物用上述限制性内切酶酶切，得到酶切产物；

3）检测酶切产物，根据酶切产物大小鉴定待测白来航鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡的红羽性状。

上述方法中，

所述酶切产物大小鉴定待测白来航鸡的红羽致因突变基因型为如下：

若待测白来航母鸡的酶切产物大小仅为253bp，则该待测白来航母鸡为红羽致因突变纯合基因型；

若待测白来航母鸡的酶切产物大小仅为288bp，则该待测白来航母鸡为非红羽致因突变型；

若待测白来航母鸡的酶切产物大小为288bp和253bp，则待测白来航母鸡为红羽致因突变杂合基因型。

或所述根据酶切产物大小鉴定待测白来航鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡的红羽性状为如下：

若待测白来航母鸡的酶切产物大小仅为253bp，则该待测白来航的母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡仅为红羽性状；

若待测白来航母鸡的酶切产物大小仅为288bp，则该待测白来航的母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡仅为非红羽性状；

若待测白来航母鸡的酶切产物大小为288bp和253bp，则该待测白来航的母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡为红羽性状和非红羽性状。

上述方法中，

所述PCR扩增的模板为待测鸡的基因组DNA。

本发明的第4个目的是提供一种选育红羽致因突变纯合基因型的白来航鸡的方法。

本发明提供选育红羽致因突变纯合基因型的白来航鸡的方法，包括如下步骤：选育上述红羽致因突变纯合基因型的白来航鸡；

或本发明提供一种选育与洛岛红公鸡杂交后代母鸡为红羽的待测白来航鸡的方法，包括如下步骤：选育上述的红羽致因突变纯合基因型的白来航鸡。

本发明的第5个目的是提供一种红羽粉壳蛋鸡配套系的培育方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1）选育上述红羽致因突变纯合基因型的白来航鸡；

2）以所述红羽致因突变纯合基因型的白来航鸡为母本，与洛岛红父本进行杂交，后代母鸡均为红羽，公雏均为非红羽，即得到红羽粉壳蛋鸡配套系。

上述待测白来航鸡为北京市华都峪口禽业有限责任公司白来航品系，包括公鸡和/或母鸡。

本发明的实验证明，根据NCBI中公布的鸡参考基因组Gallus_gallus-4.0版本序列信息11号染色体正义链第18,288,303位脱氧核苷酸上下游核苷酸序列设计引物，通过限制性片段长度多态性检测该位点基因型（SNP），对红羽致因突变纯合基因型的白来航鸡进行扩繁，选育纯系母本，该母本与洛岛红父本杂交后代母鸡100%为红羽表型，能够满足市场需求，具有广阔推广前景；另外，该限制性片段长度多态性检测方法，避免了测交选育的繁琐，缩短世代间隔、加快育种进程、降低育种成本，克服了传统常规育种中测交繁琐、世代间隔长等缺点。此外，本发明的方法可以直接鉴别公母鸡红羽致因突变位点基因型，解决了无法用传统测交方法判断公鸡红羽基因型的问题，增加公鸡判型的准确性和速度，提高了公鸡使用价值。

附图说明

图1为三种基因型PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2为三种基因型酶切琼脂糖凝胶电泳检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中鸡翅静脉采血和酚仿法均为本领域的常规操作。

红羽为全身羽毛红色。

实施例1、白来航鸡红羽致因突变基因型鉴定方法所需引物及其方法的建立

一、白来航鸡红羽致因突变位点的发现

1、提取待测鸡的基因组DNA

利用2000只北京市华都峪口禽业有限责任公司白来航品系母鸡与洛岛红公鸡杂交，统计杂交后代羽色表型，选取后代母鸡数大于5只且100%为红羽的白来航母鸡9只作为红羽组，选取后代母鸡数大于5只且100%为白羽的白来航母鸡9只作为白羽组；该2组作为待测鸡。

对待测鸡进行鸡翅静脉采血，用抗凝剂进行抗凝处理后经裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿法提取基因组DNA，以灭菌双蒸水溶解后备用，得到红羽组各只鸡基因组DNA和白羽组各只鸡基因组DNA。

2、重测序

对红羽组各只鸡基因组DNA和白羽组各只鸡基因组DNA采用IlluminaHiSeq4000测序仪进行重测序。

对重测序数据进行数据分析，具体分析步骤为：

1）利用NGS QC Toolkit对原始reads进行质量控制，剔除质量较低和含有接头或者引物的reads。

2）利用Burrows Wheeler Aligner(BWA)软件将质控后的reads比对到galGal4参考基因组上。

3）利用Picard软件标记并删除PCR重复。

4）利用SAMtools工具将每个个体的两个DNA文库的比对结果进行统计，组成这个个体的最终比对结果。

5）利用GATK软件从测序数据中进行SNP calling，根据SNP多态性进行固定指数分析（Fst），确定两组之间的显著差异区间。

6）对显著差异区间内的SNP进行验证，确定该白来航品系红羽致因突变SNP分子标记，命名为红羽SNP。

该红羽SNP位点为NCBI（Gallus_gallus-4.0版本序列信息）中公布的鸡参考基因组11号染色体正义链第18,288,303位脱氧核苷酸，也为序列1第253位；且该红羽SNP位点的核苷酸为A或G；该红羽SNP位点的基因型为AA、GG或AG。

该红羽SNP位点在常染色体。

二、白来航鸡红羽SNP位点的扩增引物的设计合成

根据上述一发现的红羽SNP位置信息设计带有酶切位点的引物，由深圳华大基因科技服务有限公司进行合成，其中：

正向引物F：5'- GCCGCCATCCTCAAGAACA -3'（序列2）

反向引物R：5'- AAAAAAAAAAAAAAAACGCAGCGCATAGAAGATCG -3'（序列3）。

三、限制性片段长度多态性检测待测白来航鸡的红羽致因突变基因型的方法建立

1、提取经测序和杂交试验验证过的具有GG、GA和AA基因型待测白来航母鸡的基因组DNA

2、PCR扩增

以上述1得到的待测白来航鸡的基因组DNA为模板，用上述二设计的正向引物F和反向引物R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（序列1）。

上述20μLPCR扩增体系如下：

2×PCR Mix （北京全式金生物技术有限公司

，AS111-03） 10μL；

ddH₂O>

正向引物F 0.4μL；

反向引物R 0.4μL；

DNA模板 1.5μL 。

上述PCR反应程序如下：

① 94℃5min

② 94℃30sec

③ 52.5℃30sec

④ 72℃30sec

⑤ Goto ② for 32 cycles

⑥ 72℃10min

⑦ 4℃保存

琼脂糖凝胶检测：采用1.5%~2%的琼脂糖凝胶进行检测，电压采用100V，电泳时间为35分钟。

结果如图1所示， PCR产物均为288bp（序列1）；Marker为DM2000，从下向上分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。

3、酶切

将上述PCR扩增产物用NruI内切酶进行酶切，得到酶切产物。

酶切体系如下：

10μL体系：

NurI内切酶 0.5>

Buffer 1 uL

PCR产物4 uL

ddH₂O4.5>

酶切反应程序：

①37℃ 1 h

② 4℃保存

将上述酶切产物采用1.5%-2%的琼脂糖凝胶进行检测，电压采用100V，电泳时间为35分钟。

结果如图2所示，1、2、3泳道GG基因型个体经NruI内切酶酶切后显示253bp一条带；4、5、6、7泳道GA基因型个体经NruI内切酶酶切后显示288bp和253bp两条带；8、9泳道AA基因型个体经NruI内切酶酶切后显示288bp一条带。Marker为DM2000，从下向上分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp；

可以看出，

GG基因型白来航母鸡的酶切产物仅有253bp一条带（该组部分鸡所在泳道1-3），该组白来航母鸡基因组中红羽SNP位点基因型均为GG（测序所得，并经杂交验证），其为红羽致因突变纯合型基因个体，即其与洛岛红公鸡杂交后代母鸡100%为红羽；253bp酶切产物测序为序列1第1-253bp；

AA基因型白来航母鸡的酶切产物仅有288bp一条带（该组部分鸡所在泳道8-9），该组白来航母鸡基因组中红羽SNP位点基因型均为AA（测序所得，并经过杂交验证），其为非红羽致因突变型个体，即该组白来航母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡100%为非红羽。288bp酶切产物测序为序列1第1-288bp；

GA基因型白来航母鸡的酶切产物有288bp和253bp的2条带（该组部分鸡所在泳道4-7），该组白来航母鸡基因组中红羽SNP位点基因型均为GA（测序所得），其为红羽致因突变杂合基因型个体，即该组白来航母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡既有红羽又有非红羽。288bp酶切产物测序为序列1第1-288bp；253bp酶切产物测序为序列1第1-253bp。

因此，可以上述方法检测待测白来航母鸡的红羽致因突变基因型或检测待测白来航鸡母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡的红羽性状，具体方法如下：

1、提取待测白来航母鸡的基因组DNA：

2、用上述二的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

3、NruI酶切PCR扩增产物，得到酶切产物。

检测酶切产物大小：

若待测白来航母鸡的酶切产物大小仅为253bp，则该待测白来航母鸡为红羽致因突变纯合基因型个体（基因组中红羽SNP位点基因型为GG），则该红羽致因突变纯合基因型的白来航鸡母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡仅为红羽性状；

若待测白来航母鸡的酶切产物大小仅为288bp，则该待测白来航母鸡为非红羽致因突变基因型个体（基因组中红羽SNP位点基因型均为AA），则该非红羽致因突变基因型白来航鸡母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡仅为非红羽性状；

若待测白来航母鸡的酶切产物大小为288bp和253bp，则待测白来航母鸡为红羽致因突变杂合基因型个体（基因组中红羽SNP位点基因型均为AG），则该红羽致因突变杂合基因型的白来航鸡母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡为红羽性状和非红羽性状。

红羽致因突变基因型为红羽致因突变纯合基因型或红羽致因突变杂合基因型：

上述红羽致因突变纯合基因型为基因组中红羽SNP位点基因型为GG，且该红羽致因突变纯合基因型的白来航母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡仅为红羽性状；

上述红羽致因突变杂合基因型为基因组中红羽SNP位点基因型为AG，且该红羽致因突变杂合基因型白来航母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡为红羽性状和非红羽性状。

上述非红羽致因突变基因型为基因组中红羽SNP位点基因型为AA，且该非红羽致因突变基因型白来航母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡仅为非红羽性状。

实施例2、红羽致因突变纯合基因型白来航鸡母本选育及红羽粉壳蛋鸡配套系的建立

一、红羽致因突变纯合基因型白来航鸡母本选育

1、提取基因组DNA

提取1573只待测白来航母鸡的基因组DNA。

2、PCR扩增

分别以1573只待测白来航母鸡的基因组DNA作为模板，用实施例1中上述三的方法中的步骤2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、酶切

NruI酶切上述各只鸡的PCR扩增产物，得到酶切产物。

检测酶切产物大小：

若待测白来航母鸡的酶切产物大小仅为253bp，则该待测白来航母鸡为红羽致因突变纯合基因型个体，则该红羽致因突变纯合基因型的白来航鸡母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡仅为红羽性状；

若待测白来航母鸡的酶切产物大小仅为288bp，则该待测白来航母鸡为非红羽致因突变基因型个体，则该非红羽致因突变基因型白来航鸡母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡仅为非红羽性状；

若待测白来航母鸡的酶切产物大小为288bp和253bp，则待测白来航母鸡为红羽致因突变杂合基因型个体，则该红羽致因突变杂合基因型的白来航鸡母鸡与洛岛红公鸡杂交后代母鸡为红羽性状和非红羽性状。

结果如下：

1573只待测白来航母鸡中962只酶切产物大小仅为253bp，判断这些母鸡为红羽致因突变纯合基因型个体，其与洛岛红公鸡杂交后代中的母鸡为红羽；

1573只待测白来航母鸡中19只酶切产物大小仅为288bp，判断这些母鸡为非红羽致因突变基因型个体，其与洛岛红公鸡杂交后代中的母鸡为非红羽；

1573只待测白来航母鸡中592只酶切产物大小为288bp和253bp，判断这些母鸡为红羽致因突变杂合基因型个体，其与洛岛红公鸡杂交后代中的母鸡中有红羽和非红羽。

实验验证：

将上述方法鉴定中962只红羽致因突变纯合基因型个体作为母本与洛岛红公鸡杂交，检测其杂交后代，得到3620只母鸡，其中红羽的为3620只。

将上述SNP鉴定中592只红羽致因突变杂合基因型个体作为母本与洛岛红公鸡杂交，检测其杂交后代，得到2257只母鸡，其中红羽的为1182只，非红羽的1075只。

将上述SNP鉴定中19只非红羽致因突变型个体作为母本与洛岛红公鸡杂交，检测其杂交后代，得到61只母鸡，其中红羽的为0只，非红羽的61只。

从上述杂交结果可以看出，与本发明方法鉴定结果一致，因此，可以看出，本发明的引物及其方法可以用来鉴定待测白来航鸡的红羽致因突变基因型，并且可以用来判断待测白来航鸡与洛岛红鸡杂交后代的羽毛颜色性状。

二、红羽粉壳蛋鸡配套系的建立

将GG基因型白来航鸡母鸡与洛岛红公鸡进行杂交配套，后代母鸡均为红羽，公雏均为非红羽，实现红羽粉壳蛋鸡配套系的建立。

三、红羽致因突变纯合基因型或红羽致因突变杂合基因型白来航公鸡的应用

由于红羽SNP位点位于常染色体，因此，GG型和GA型白来航母鸡的全同胞公鸡也可以用上述二的方法进行红羽致因突变基因型判定，选留GG型白来航公鸡。

将GG型白来航公鸡与所有GG型白来航母鸡个体进行扩繁和选育，经过四个世代的选育后得到红羽致因突变纯合基因型白来航鸡纯系，红羽SNP位点基因型为GG型。

序列表

<110>北京市华都峪口禽业有限责任公司

<120> 白来航鸡红羽致因突变基因型鉴定及红羽粉壳蛋鸡配套系培育方法

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>288

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gccgccatcc tcaagaacag gaatctgcac tcgcccatgt actacttcat ctgctgcctg60

gccgtctccg acatgctggt gagcgtcagc aacctggccg agacgctctt catgctgctg120

atggagcacg gcgtgctggt gatccgcgcc agcatcgtcc gccacatgga caatgtcatc180

gacatgctca tctgcagctc cgtcgtgtcc tccctctcct tcctgggggt catcgccgtg240

gaccgctaca tcacgatctt ctatgcgctg cgtttttttt tttttttt 288

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gccgccatcc tcaagaaca 19

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

aaaaaaaaaa aaaaacgcag cgcatagaag atcg34