Marc-145细胞周期同步化及PRRSV细胞受体表达与病毒感染的关系

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病，是危害养猪业的主要传染病之一。该病于1987年首先在美国爆发，而后在全球范围内迅速蔓延开来，该病毒于1996年首次在中国大陆分离到，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。
　　 PRRSV感染宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合，利用细胞的内吞作用而感染细胞。至今，已经报道的与PRRSV感染相关的细胞受体有唾液酸粘附素(Sialoadhesin，Sn)、硫酸乙酰肝素（Heparin sulphate，HS）、波形蛋白(Vimentin)、清道夫受体(CD163)。本实验室利用针对PRRSV GP5蛋白的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2)，在PRRSV易感细胞上发现并证明了非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(Non-musclemyosin heavy chainⅡ A，NMHC-ⅡA)为PRRSV的细胞受体蛋白。
　　 一个完整的细胞周期是指细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成的过程。在这一完整的过程中，细胞的染色体得到复制，细胞内各组分含量加倍，最后平均分配到两个子代细胞中。通常一个的细胞周期可以划分为四个连续的时相:G1期、S期、G2期和M期。在同种细胞组成的细胞群体中，不同的细胞可能处于细胞周期的不同时期，处于细胞周期不同阶段的细胞，其形态学和生化特性均有所不同，对药物、辐射、病毒的感染也均有所不同。本研究的目的是将Marc-145细胞同步化，研究处于不同细胞周期的Marc-145细胞上PRRSV受体的差异及与PRRSV感染之间的相互关系。
　　 1.Marc-145细胞同步化方法的建立:通过探索血清饥饿法与药物阻滞法等细胞同步化方法，最终确立了同步化Marc-145细胞的方法:用含1％FBS的DMEM培养基饥饿细胞72h将细胞同步化至G0/G1期;同步化至G0/G1期的细胞重新按1×105个/mL的细胞数传代，然后用含10％ FBS的DMEM培养基继续培养17h，将细胞同步化至S期;在同步化至S期的细胞培养基中加入0.05μg/mL的Nocodazole作用8h，将细胞同步化至G2/M期。
　　 2.PRRSV对不同周期Marc-145细胞的易感性:为阐明PRRSV对处于不同周期细胞的易感性，用PRRSV感染处于不同细胞周期的Marc-145细胞，检测病毒的吸附与感染。检测结果显示，处于G2/M期的Marc-145细胞比处于S期的Marc-145细胞易被PRRSV感染。
　　 3.PRRSV细胞受体在Marc-145细胞不同周期内的表达水平:为了解析PRRSV对处于不同细胞周期的易感性的差异，对处于不同细胞周期的Marc-145细胞内PRRSV细胞受体表达水平进行了测定。试验结果显示，CD163在G0/G1期细胞内表达水平最高，G2/M期次之，S期的表达量最低; NMHC-ⅡA在G2/M期内表达水平最高，G0/G1期次之，S期的表达量最低;Vimentin则在不同的细胞周期内的表达量变化不大。
　　 这些结果显示PRRSV对不同细胞周期细胞的易感性不同，这有可能是Marc-145细胞不同周期内病毒受体表达量的不同导致，为后期研究PRRSV感染细胞的分子机理奠定基础。

目录

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论文说明

符号说明

摘要

1 引言

1．1 细胞周期

1．2 细胞周期调控

1．2．1 细胞周期检测点

1．2．2 细胞周期的调控蛋白

1．2．3 细胞周期调控蛋白的降解

1．3 细胞周期同步化

1．4 猪繁殖与呼吸综合征概述

1．5 PRRSV生物学特征

1．6 PRRSV基因组结构

1．6．1 非结构蛋白

1．6．2 结构蛋白

1．7 PRRSV免疫学研究进展

1．7．1 体液免疫

1．7．2 细胞免疫

1．8 PRRSV受体的研究进展

1．8．1 硫酸乙酰肝素

1．8．2 唾液酸粘附素

1．8．3 CD163

1．8．4 波形蛋白

1．8．5 非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A

1．9 病毒感染与细胞周期

1．9．1 病毒感染对细胞G1／S检查点的调控

1．9．2 病毒感染对细胞G2／M期休眠的调控

1．10 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞、毒株与抗体

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要试剂与药品

2．1．4 主要试剂配制

2．1．5 主要设备及仪器

2．2 方法

2．2．1 Marc-145细胞的传代培养及PRRSV增殖

2．2．2 单克隆抗独特型抗体5G2与6D10的制备与纯化

2．2．3 Marc-145细胞周期同步化方法的建立

2．2．4 统计学处理

2．2．5 PRRSV在Marc-145细胞不同周期内的易感性测定

2．2．6 Marc-145细胞不同周期内PRRSV细胞受体表达量测定

3 结果与分析

3．1 单克隆抗独特型抗体5G2以及抗PRRSV N蛋白单克隆抗体6D10的制备与纯化

3．2 Marc-145细胞周期同步化方法的建立

3．2．1 Marc-145细胞G0／G1期细胞周期同步化方法的建立

3．2．2 Marc-145细胞S期细胞周期同步化方法的建立

3．2．3 Marc-145细胞G2／M期细胞周期同步化方法的建立

3．2．4 药物Nocodazole对Marc-145细胞分裂的影响

3．3 PRRSV在Marc-145细胞不同周期内的易感性测定

3．3．1 实时荧光定量(Real time PCR)测定PRRSV在Marc-145细胞不同周期内的吸附性差异

3．3．2 间接免疫荧光(IFA)测定PRRSV在Marc-145细胞不同周期内的感染差异

3．3．3 Western blot测定PRRSV在Marc-145细胞不同周期内的感染差异

3．3．4 TCID50测定PRRSV感染不同周期Marc-145细胞后上清病毒含量的差异

3．4 Marc-145细胞不同周期内PRRSV细胞受体表达水平的检测

3．4．1 Marc-145细胞不同周期内PRRSV细胞受体基因水平的检测

3．4．2 Marc-145细胞不同周期内PRRSV细胞受体蛋白水平的检测

4 讨论

4．1 Marc-145细胞周期同步化方法的建立

4．2 Marc-145细胞不同周期对PRRSV感染细胞的影响

4．3 Marc-145细胞不同周期PRRSV细胞受体表达水平的差异

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况