4株NDV流行株的全基因测序分析及鸭源NDV HN蛋白的原核表达

摘要

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒引起的能够感染多种禽类的一种急性、高度传染性疫病，是危害世界养禽业的重要传染病之一，给许多国家的养禽业造成巨大的经济损失。NDV对多种禽类都具有致病性，除家禽外，至少250种鸟类可自然或实验感染NDV。基因Ⅶ型NDV是我国当前流行最广的毒株。
　　 为研究近年来NDV的遗传进化趋势，本文通过克隆测序测定了两株基因Ⅶ型鸡源新城疫分离株Chicken/China/SD04/2011和Chicken/China/SDWF07/2011及两株基因Ⅵ型鸽源新城疫分离株Pigeon/China/SDLC/2011和Pigeon/China/SDS/2011的全基因序列。4株病毒与中国标准强毒F48E8、国外标准强毒Hefts/33及疫苗株chicken/N.Ireland/Ulster/67、B、Clone30、LaSota、Mukteswar核苷酸序列同源性在80％～87％之间;其F蛋白前体F0裂解位点附近的氨基酸序列均为112RRQKRF117，符合NDV强毒株的特征;两株鸡源病毒属于基因Ⅶd亚型变异株;两株鸽源毒株NP、P、L基因上某些氨基酸的改变与其宿主特异性及毒力方面的差异可能有关。抗原变异分析结果显示与单抗1E5反应阴性，初步推测并不是由HN蛋白347位氨基酸变异E→K(G)引起的，可能还有其他未知的因素决定了病毒与单抗1E5的反应特性。Pigeon/China/SDS/2011对鸽和鸡的人工感染试验结果显示其对鸽具有较强的致病性而对鸡的致病性较弱。
　　 2009年本实验室从发生NDV的鸭场分离得到一株鸭源新城疫病毒SD03，序列分析与致病性指数测定结果显示为强毒株。但其对樱桃谷鸭的攻毒试验显示，在实验条件下SD03分离株对鸭不致病，只表现排毒。在本试验中用原核表达载体pET28a对其HN蛋白开放阅读框内176～571位氨基酸（包含有5个与受体结合有关的区域）进行了表达。表达产物经SDS-PAGE检测在49kDa位置处有明显表达带，表达产物经镍柱亲和纯化后SDS-PAGE电泳检测，获得较纯的目的重组蛋白。Western blotting分析结果表明纯化的蛋白能和针对NDV HN蛋白上与血凝特性和中和活性有关抗原位点的单抗及兔多抗发生特异性反应，说明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。为下一步制备单克隆抗体进而更深入地研究其抗原表位奠定了基础。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 NDV一般生物学特性

1．1．1 NDV的分类地位与形态

1．1．2 NDV的理化特性

1．1．3 NDV的培养特性

1．1．4 NDV的生物学活性

1．1．5 NDV的血清型

1．1．6 NDV的毒力与致病性

1．1．7 NDV的毒株分类

1．2 NDV的基因组结构

1．3 NDV各个基因结构蛋白的分子生物学研究

1．3．1 F蛋白分子生物学研究

1．3．2 HN蛋白的分子生物学研究

1．3．3 M蛋白的分子生物学研究

1．3．4 NP蛋白、P蛋白和L蛋白及其分子生物学研究进展

1．4 NDV的分子流行病学

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 毒株、单抗和载体

2．1．2 主要试验试剂与耗材

2．1．3 主要试验设备和仪器

2．2 方法

2．2．1 4株新城疫病毒的全基因测序

2．2．2 抗原变异分析

2．2．3 鸽源分离株的人工感染试验

2．2．4 鸭新城疫HN蛋白原核表达载体构建和表达

3 结果

3．1 4株新城疫病毒的全基因测序

3．1．1 生物学特性测定

3．1．2 全基因组分析

3．1．3 同源性及遗传进化分析

3．2 抗原变异分析

3．2．1 抗原变异分析反应性

3．2．2 HN蛋白抗原线性位点氨基酸位点变异分析

3．3 鸽源NOV的人工感染试验

3．4 鸭NDV HN蛋白原核表达

3．4．1 HN基因RT-PCR扩展结果

3．4．2 HN基因表达载体的构建及鉴定

3．4．3 表达产物的SDS-PAGE电泳分析

3．4．4 HN蛋白的纯化及Western blotting分析结果

4 讨论

4．1 4株新城疫病毒的全基因测序

4．2 抗原变异分析

4．3 鸽源新城疫的人工感染试验

4．4 鸭NDVHN蛋白的原核表达

5 结论

参考文献

附录 溶液的配制

致谢

作者简介及论文发表情况