分泌抗鸭源NDV分离株单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立

摘要

本发明涉及分泌抗鸭源NDV分离株单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立，属于分子免疫学和病毒学技术领域。本发明以鸭NDV分离株SD03原核表达纯化的HN蛋白为免疫原，研制了1株能分泌抗鸭源NDV分离株单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为保藏号为CCTCC C2013173。该杂交瘤细胞株分泌的NDV特异性单克隆抗体不会和新城疫疫苗株发生特异性结合，而能和新城疫临床野毒株发生特异性结合；从而能作为鉴别试剂用于新城疫疫苗毒LaSota和临床野毒株的鉴别。该单克隆抗体可作为实验室鉴别试剂用于鉴别新城疫疫苗毒和临床野毒株，其特异性强；其灵敏度为1：212血凝单位；具备灵敏度高的优点。

说明书

技术领域

    本发明涉及分泌抗鸭源NDV分离株单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立，属于分子免疫学和病毒学技术领域。 

背景技术

新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒引起多种禽类的一种急性、高度接触性传染病，是危害世界养禽业的重要传染病之一，给各国养禽业造成了严重的经济损失。新城疫病毒属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒亚科（Paramyxovirus）腮腺炎病毒属成员，其宿主范围广泛，迄今已知能自然或人工感染的鸟类超过250种。自1926年从印度尼西亚爪哇首次分离到NDV以来，世界上已发生了4次ND大流行，虽然NDV只有一个血清型，但是每次ND流行都会有新的基因型出现，且具有一定的地域性。ND病毒(NDV)的分子流行病学研究表明:自20世纪90年代中期以来,我国流行的NDV强毒,在鸽上主要为Ⅵb亚型，其他家禽90%以上为基因Ⅶ型。基因Ⅶ型病毒与我国使用最广泛的基因Ⅱ型疫苗病毒(LaSota)之间存在明显的遗传差异和抗原差异,这是我国免疫鸡群发生非典型ND的最重要的原因。 

目前区分疫苗株LaSota和野毒株的方法有：一，分离病毒测定生物学毒力指标，包括鸡胚平均死亡时间（MDT）、1日龄鸡胚脑内接种指数（ICPI）、6周龄鸡静脉内接种致病指数（IPVI）；二，通过一对NDV特异的简并引物，进行RT-PCR扩增，获得的PCR扩增片段并送公司进行测序,根据序列即可判断强弱毒。上述方法均繁琐费时。 

发明内容

本发明以鸭NDV分离株SD03原核表达纯化的HN蛋白为免疫原，研制了1株能分泌抗鸭源NDV分离株单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该杂交瘤细胞株分泌的NDV特异性单克隆抗体不会和新城疫疫苗株发生特异性结合，而能和新城疫临床野毒株发生特异性结合；从而能作为鉴别试剂用于新城疫疫苗毒LaSota和临床野毒株的鉴别。 

本发明的杂交瘤细胞株，保藏号为CCTCC C2013173。该杂交瘤细胞株能分泌抗鸭源NDV单克隆抗体；杂交瘤细胞株生长至上清变黄时，开始分泌抗鸭源NDV单克隆抗体。 

本发明还提供了一种抗鸭源NDV单克隆抗体，由保藏号为CCTCC C2013173的杂交瘤细胞株产生。该单克隆抗体在杂交瘤细胞株生长至上清变黄开始分离，说明本发明的抗体物理宏观特征明显，易于获取。该单克隆抗体可作为实验室鉴别试剂用于鉴别新城疫疫苗毒和临床野毒株，其特异性强；其灵敏度为1：2¹²血凝单位；具备灵敏度高的优点。 

本发明还提供了一种用于鉴别新城疫疫苗毒和临床野毒株的试剂，含有保藏号为CCTCC C2013173的杂交瘤细胞株产生的抗鸭源NDV单克隆抗体。该试剂，其中抗鸭源NDV单克隆抗体的浓度为1.51mg/mL。 

    本发明还提供了一种采用上述抗鸭源NDV单克隆抗体鉴别新城疫疫苗毒和临床野毒株的方法，是以碳酸盐缓冲液稀释的10％体积浓度的病毒液包被96孔ELISA 板，100μl/孔，4℃过夜；PBST洗板3次，拍干；加入封闭液，350μl/孔，37℃培养箱孵育2h，洗涤3次，拍干；将1.51mg/mL抗鸭源NDV单克隆抗体加入各孔，100μl/孔，37℃培养箱孵育1h，洗3次，拍干；用封闭液将HRP羊抗鼠IgG酶标二抗按1:5000稀释，100μl/孔，置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，拍干；以TMB底物显色液，按100 μl/孔加入包被板，室温下避光显色20min加终止液，2M H2SO4终止显色，450nm检测各孔的OD值；OD值小于等于0.3865为阴性，表示被测病毒为新城疫疫苗毒；OD值大于0.3865为阳性，表示被测病毒为新城疫临床野毒株。所述封闭液、终止液均为本领域常规试剂。 

本发明的保藏号为CCTCC C2013173的杂交瘤细胞株是通过对SEQ ID NO.1所示基因序列的NDV-HN蛋白的表达和纯化，免疫动物，细胞融合等实验步骤实现的。 

制备分泌抗鸭源NDV单克隆抗体杂交瘤细胞株的具体步骤如下：

采用PCR扩增法获取如SEQ ID NO.1所示基因片段，所用正向引物为5′- CCGGAATTCATACCCTCATTTGACATGAG-3′如SEQ ID NO.2所示，含EcoRI酶切位点；所用反向引物为: 5′-  CCCAAGCTTTTAAACTCTATCATCCTTGAGG-3′如SEQ ID NO.3所示，含HindⅢ酶切位点。然后段利用pET28(a)质粒获得p ET28(a)-HN重组质粒。用IPTG诱导表达带有HIS标签的His-HN融合蛋白，采用蛋白纯化试剂盒纯化His-HN融合蛋白。纯化后的His-HN融合蛋白免疫Balb/C小鼠，然后获取小鼠脾淋巴细胞。将瘤细胞SP2/0与被免疫的小鼠的脾淋巴细胞融合，然后滴加于提前铺入饲养细胞的96孔细胞培养板，于细胞培养箱中培养。5d后每个细胞培养孔补加原孔一半体积的新鲜配置的HAT培养基，待融合的杂交瘤细胞生长至孔底十分之一，且上清变黄时进行检测和筛选。

筛选杂交瘤细胞的方法： 

方法一、 酶联免疫吸附实验  将纯化后的原核表达产物His-HN融合蛋白包被ELISA板，将杂交瘤细胞分泌的单抗（即细胞培养物上清）与之结合，阳性孔的OD值与阴性对照的OD值得比值不小于2；

方法二、Western Blot  采用蛋白转印免疫印迹方法确定与单抗发生结合反应的蛋白分子量，出现特异性反应的蛋白条带，筛选得到抗NDV-HN的单克隆抗体；

方法三、细胞间接免疫荧光  将SD03病毒接种鸡胚成纤维细胞，使该单抗与病毒结合，采用间接免疫荧光筛选抗NDV-HN的单克隆抗体，在荧光显微镜下观察。

通过上述方法一筛选得到阳性克隆，将其扩大培养并进行3次亚克隆得到一株稳定分泌抗新城疫病毒SD03的杂交瘤细胞1C8。利用方法二和方法三对利用该杂交瘤细胞制备的单抗进行生物免疫学技术研究，进一步鉴定其生物学特性。 

本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关技术术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。 

保藏信息

保藏时间：2013年11月30日

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心   

保藏编号：CCTCC  NO：C2013173

保藏单位地址：中国. 武汉. 武汉大学   

分类命名: 杂交瘤细胞株1C8

附图说明

图1为 His-HN蛋白纯化后的十二烷基熿酸钠-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）图， 

图中M为Protein marker (KD) 1:未纯化的重组蛋白；2：过柱纯化的重组蛋白；

图2为单抗1C8与HN蛋白特异性结合蛋白质免疫印迹（Western blot）图，

图中M为Protein Marker (KD); 1:1C8与表达蛋白的免疫印迹2:1C8与SD03病毒尿囊液蛋白的免疫印迹；

图3为间接免疫荧光检测法检测单克隆抗体(200倍)图，

图中 A为阳性对照; B为单抗1C8;C为 阴性对照。

具体实施方式

实施例1

NDV-HN基因的克隆及测序

参照NDV鸭源分离株SD03的HN基因序列，设计合成HN基因表达引物， 正向引物为5′- CCGGAATTCATACCCTCATTTGACATGAG-3′如SEQ ID NO.2所示，含EcoRI酶切位点，反向引物为 5′-  CCCAAGCTTTTAAACTCTATCATCCTTGAGG-3′如SEQ ID NO.3所示，含Hind Ⅲ酶切位点。利用上述引物PCR扩增SD03的 HN基因开放阅读框内523-1716位核苷酸，DNA纯化试剂盒纯化回收PCR产物，将其插入pET28(a)载体，获得pET28(a)-HN重组质粒。将该重组质粒按常规方法转化入CaCl₂ 法制备的感受态细胞BL21，酶切法鉴定阳性克隆，阳性克隆送往测序公司测序，所述NDV-HN基因的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

上述所采用的PCR扩增、EcoRI和HindⅢ双酶切、DNA回收、连接与转化等均为现有技术。 

实施例2

 His-HN蛋白的表达和纯化

1）将含有重组质粒的BL21菌接种于含卡那霉素(Kan)的LB固体培养基，37℃培养挑取单菌落接种于含Kan (终浓度为50μg/ml)的500ml LB液体培养基中，37℃振荡(200rpm)，培养至0D600=0.6，加入IPTG至终浓度为 0.6mmol/L，37℃继续培养6h，大量诱导表达HN蛋白。

2）将上述菌液12,000g，4℃，20min离心后弃上清，用15ml PBS重悬。超声波破碎菌体。 

3）4℃，12,000g离心20min，收集沉淀。 

4）用Washimg buffer对上一步获得的沉淀进行充分的洗涤，12,000g，4℃离心20min，弃去上清，尽量的将细菌碎片除去。 

5）将上一步得到的沉淀再用Resuspension buffer进行充分的悬浮，12,000g，4℃离心20min，弃去上清，称量包涵体的重量。 

然后按照His·Bind Purification Kit 说明书的实验步骤对获得的包涵体进行纯化，具体步骤略，SDS-PAGE分析蛋白纯化的结果，用考马斯亮蓝法（Bradford）法测定纯化蛋白的浓度。 

上述蛋白纯化按照His·Bind Purification Kit蛋白纯化试剂盒说明书步骤进行，Washimg buffer、Resuspension buffer为试剂盒中试剂；Bradford法测蛋白浓度及SDS-PAGE电泳的具体实验步骤参照分子克隆实验指南（科学出版社2002 [美]J.萨姆布鲁克 D.W 拉塞尔 著，黄培堂等译）进行。 

实施例3

动物免疫

以上述提纯的His-HN融合蛋白免疫6周龄Balb/C雌性小鼠，每次每只的免疫剂量为50ug，免疫方法为腹腔注射，共免疫四次。每次免疫的间隔期为2周，首免用弗氏完全佐剂按体积比1:1的比例乳化蛋白，二免至四免用弗氏不完全佐剂按体积比1:1乳化蛋白。三次免疫一周后,小鼠眼眶采血测其效价,监测血清抗体效价。 四免两周后,选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的蛋白腹腔注射加强免疫一次，3d后取小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合。

实施例4

 细胞融合

融合前1～2d按照常规方法制备腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，将其密度调整为2-5×10⁵/ml，按照100ul/孔铺入96孔板。将培养板放入37℃5%CO2培养箱中培养，备用。   

免疫小鼠眼球采血，制备血清备用。无菌操作取小鼠脾脏，剔除脂肪组织后，按照常规方法制备脾脏淋巴细胞，活细胞计数后备用。

用无血清DMEM培养基将处于对数生长期的SP2/0吹下，加入融合管内，将免疫脾脏淋巴细胞也加入同一融合管内；1000rpm离心10min后弃上清，将融合管置手掌上来回轻轻震动以使沉淀松散。45s内加入1 mL预热的浓度为50%的PEG1500，再于90s内加入DMEM培养基30mL，37℃温育15min后800rpm离心10min，用60mLHAT培养基悬浮，滴加于提前铺入饲养细胞的96孔细胞培养板，置37℃，5-6%CO2的细胞培养箱中培养。5d后每个细胞培养孔补加原孔一半体积的新鲜配置的HAT培养基，然后每天观察SP2/0细胞和脾细胞对照孔，当SP2/0细胞和脾细胞全部死亡时，用新鲜配制的HT培养基全部置换出HAT培养基。逐日观察，待融合的杂交瘤细胞生长至孔底十分之一，且上清变黄时进行检测。 

实施例5

阳性克隆的筛选与亚克隆

克隆的筛选主要采用酶联免疫吸附试验（ELISA）：

1） 包被：取纯化的重组蛋白His-HN，以碳酸盐缓冲液（每200ml碳酸盐缓冲液含Na₂CO₃ 0.32g，NaHCO₃ 0.58g）稀释至1ug/mL包被反应板，100μl/孔，4℃过夜。

2） 洗涤：甩去酶标板中的包被液，用PBST（PBS，0.05%Tween-20）加满各孔，室温静置3min，弃去PBST，洗涤3次，拍干。 

3) 封闭：各孔加入封闭液（含5% BSA的PBST），350μl/孔，置37℃培养箱孵育2h，洗涤3次，3min/次，拍干。 

4) 加样：将待检血清按梯度稀释后加入包被板，100μl/孔，同时设立阴阳性血清对照。置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，拍干。 

5) 用封闭液将HRP羊抗鼠IgG酶标二抗按1:5000稀释，100μl/孔，置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，拍干。 

6) 显色：使用TMB单组份显色试剂盒（TIANGEN公司产品）按100 μl/孔加入包被板，室温下避光显色20min加终止液，2M H₂SO₄终止显色。 

7) 用酶联免疫检测仪测其在波长450nm检测各个孔的OD值，阴性对照OD₄₅₀值为N，阳性对照OD₄₅₀值为P。 

ELISA阳性孔细胞留作扩大培养用，再经3次亚克隆获得稳定分泌抗SD03单抗的杂交瘤细胞株1C8。 

实施例6

1C8的生物学特性的进一步鉴定

（1）间接免疫荧光检测法（IFA）

使用9日龄SPF鸡胚按常规方法制备鸡胚成纤维细胞，铺入96孔细胞培养板，使用含10%胎牛血清的DMEM培养待细胞长成单层时接种SD03毒株，37℃作用2h后，更换含1%胎牛血清的DMEM，3天后做IFA检测，步骤如下：

倒出细胞培养液，用PBS洗3次 每次3min；丙酮：乙醇（3:2）固定细胞7-8 min，用PBS洗3次，每次5min；以细胞培养上清为一抗按100μL/孔加入，37℃温箱抚育60 min，用PBS洗3次，每次5min；以FITC标记羊抗鼠IgG为二抗，37℃温箱60 min，用PBS洗3次，每次5min；每孔加入100μl 50%甘油；倒置荧光显微镜下观察，拍照，其结果如图3所示。

（2）Western-blot检测 

1）取1mL诱导表达的菌液，12000r/min，离心2min，弃上清，加100μl灭菌双蒸水，悬浮沉淀，加100μl 2x上样缓冲液，煮沸5-10min。取20μl/孔加样，进行SDS-PAGE电泳。

2）剪一张与凝胶大小相同的NC膜，用去离子水浸透，同时将与凝胶大小相同的两张滤纸及纤维垫用转印缓冲液浸透。 

3）按三明治法安装转印装置，即负极夹-纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫-正极夹，使NC膜位于转印的正极面，凝胶位于负极面，其间无任何气泡间隙。将转印装置放入转移电泳仪中，加入转移缓冲液，140mA电泳2h。 

4）转印结束后，将转移后的NC膜用去离子水漂洗一遍，将NC膜浸泡于封闭液中，4℃封闭过夜。用PBST洗涤NC膜三遍，每次10 min。 

5）一抗孵育：弃去封闭液，将NC膜放入用TBST按一定比例稀释好的一抗（针对NDV HN蛋白上与血凝特性和中和活性有关抗原位点的单抗和兔多抗）中，于平缓摇动的水平摇床上37℃温育2h（或4℃过夜）。 

6）二抗孵育：弃去一抗，用TBST洗涤NC膜3次，每次10min。将NC膜移至用封闭液按一定比例稀释好的二抗（HRP标记的山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG）中，于平缓摇动的水平摇床上37℃温育2h。 

7）蛋白检测：弃去二抗溶液，用TBST洗涤3次，每次10min。之后于暗室中将NC膜移至新鲜配制的ECL超敏发光液中显色。将发光显色的NC膜用保鲜膜覆盖，平铺于曝光夹内。在其上放入一张适当大小的X光胶片，曝光5min～30min。取出胶片放入显影液内，振荡直至条带可见后定影，清水冲洗，结果如图2所示。1C8与SD03全病毒蛋白及表达的HN蛋白均能反应。 

实施例7

单抗亚型的鉴定

利用SBA单克隆抗体分型试剂盒（5300-01）对1C8杂交瘤细胞培养上清进行亚型的鉴定，具体步骤参见试剂盒说明书。该试剂盒主要是采取双抗体夹心法，先在96孔板上包被抗体捕获二抗，然后加入待测的分泌1C8杂交瘤细胞的培养物上清液，37℃温育1h。培养上清液中的目标蛋白（即1C8单抗）便会与96孔板上固相二抗结合，PBST洗板去除未结合的游离物质，然后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的酶标二抗，37℃孵育1h，洗板去除游离物质，加入TMB底物显色液显色15～30min，加入终止液终止反应，在450nm处测定OD值。

通过实验分析，1C8单抗属于IgG1，κ链。 

实施例8

 单抗1C8与疫苗株及实验室分离株的反应性

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定单抗1C8与NDV疫苗株及其他毒株包括标准强毒株、实验室分离株的反应性。具体是以碳酸盐缓冲液稀释的1:10的病毒液包被96孔ELISA 板，100μl/孔，4℃过夜；PBST洗板3次，拍干；加入封闭液，350μl/孔，37℃培养箱孵育2h，洗涤3次，拍干；将1:20000稀释的1C8（1.51mg/mL）纯化的单抗加入各孔，100μl/孔，同时设立阴、阳性对照，37℃培养箱孵育1h，洗3次，拍干；用封闭液将HRP羊抗鼠IgG酶标二抗按1:5000稀释，100μl/孔，置37℃培养箱孵育1h，洗涤3次，拍干；以TMB底物显色液，按100 μl/孔加入包被板，室温下避光显色20min加终止液，2M H2SO4终止显色，450nm检测各孔的OD值。（病毒和碳酸盐缓冲液的体积比为1:10）

表1是1C8与NDV疫苗株及其他毒株的ELISA反应性结果，结果表明1C8与疫苗株LaSota ELISA结果阴性，与其他不同亚群和不同基因型的NDV分离株ELISA反应阳性，1C8单抗可作为实验室诊断试剂用于鉴别诊断新城疫疫苗毒和临床野毒株。

表1 ，单抗1C8与 NDV疫苗株和其他毒株在ELISA实验中的反应性 

序号 NDV 分离株分离时间宿主亚群/基因型ELISA 结果1 疫苗株LaSota —家禽ClassⅡ/Ⅱ－2 标准强毒株F48E8 —家禽ClassⅡ/Ⅸ+ 3SD03—肉鸭ClassⅡ/Ⅶ+4 D582009肉种鸭ClassⅠ/？+ 5 D10 2009肉种鸭ClassⅠ/？+ 6 D552009肉种鸭ClassⅠ/？+ 7 D162009肉种鸭ClassⅠ/？+ 8 292009肉种鸭ClassⅠ/？+ 9 5782011肉种鸭ClassⅡ/I+ 10 3572009肉种鸭ClassⅡ/Ⅶ+ 11 3552009肉种鸭ClassⅡ/Ⅶ+ 12 8342012商品肉鸭ClassⅡ/Ⅶ+ 13 4512011商品肉鸡ClassⅡ/Ⅶ+ 14 4572010商品肉鸡ClassⅡ/Ⅶ+ 15 5172011种鸡ClassⅡ/Ⅶ+ 16 5762011种鸡ClassⅡ/Ⅶ+ 17 8832013商品肉鸡ClassⅡ/Ⅶ+ 18 8892013商品肉鸡ClassⅡ/Ⅶ+ 19 3532009肉鸽ClassⅡ/Ⅶ+ 20 6132011肉鸽ClassⅡ/Ⅵ+ 216572011肉鸽ClassⅡ/Ⅵ+

注：①“－”表示反应阴性；②“＋”表示反应阳性；③“？”表示未知。 

<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>分泌抗鸭源NDV单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

<160>3

   

<210>1

<211>1194

<212>新城疫病毒（Newcastle disease virus）

<213>DNA

<400>1

ataccctcat ttgacatgag caccacccat tattgttata ctcacaatgt gatactatcc     60

ggttgcagag atcactcaca ctcacatcaa tacttagcac ttggtgtgct tcggacatct     120

gcaataggga gggtattctt ttctactctg cgctccatcg atttagatga cacccaaaat     180

cggaagtcct gcagtgtaag tgcaacccct ttaggttgtg atatgctgtg ctctaaggtc     240

acagggactg aagaggagga ttacaagtca gttgccccca catcaatggt gcacggaagg     300

ctagggtttg acggtcaata ccatgagaag gacttagaca ccacggtctt atttaaggat     360

tgggtggcaa attacccggg agtgggagga gggtctttta ttgacggccg tgtatggttc     420

ccagtttacg gagggctcaa acccaattca cccagtgaca ctgcacaaga agggaaatat     480

gtaatataca agcgccataa taacacatgc cccgatgaac aagattacca aattcggatg     540

gctaagtcct catataaacc cgggcgattt ggtggaaagc gcgtacagca agccatccta     600

tccatcaaag tgtcaacgtc cctgggtaag gacccggtgc tgactattcc acctaataca     660

atcacactca tgggagccga aggcagaatc ctcacagtag ggacatctca cttcttgtac     720

caacgagggt cttcatactt ctcccctgcc ctattgtatc ccatgacagt aaataacaaa     780

acggctacac tccatagtcc ttacatgttt aatgctttca cccggccagg tagtgtccct     840

tgccaggcat cagcaagatg ccccaactca tgcattactg gggtctatac cgatccatat     900

cccttagtct tccataggaa tcatactcta cgaggggtct tcgggacgat gcttgatgat     960

gaacaagcga ggcttaaccc cgtatctgca gtatttgaca acatatctcg cagtcgtgtc     1020

acccgggtga gttcaagcag caccaaggca gcatacacga catcgacatg ttttaaagtt     1080

gtcaagacca ataaagttta ttgtcttagt atcgcagaaa tatccaatac cctattcgag     1140

gaacttagga tcgttgcctt actagttgag atcctcaagg atgatagagt ttaa           1194                                            

 

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ccggaattca taccctcatt tgacatgag                                             29

 

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cccaagcttt taaactctat catccttgag g                                    31