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摘要
1 引言
1.1 坦布苏病毒病概述
1.2 TMUV的生物学特性
1.2.1 TMUV的分类地位
1.2.2 黄病毒的形态结构
1.2.3 黄病毒的基因组及编码蛋白
1.2.4 黄病毒的复制机制
1.2.5 黄病毒基因组末端倒置互补序列
1.2.6 TMUV的研究进展
1.3 RNAi研究进展
1.3.1 RNAi概念
1.3.2 RNAi在抗病毒治疗中的应用
1.3.3 黄病毒RNAi研究进展
1.4 腺病毒载体研究进展
1.5 研究的目的意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 病毒株及抗体
2.1.2 实验动物及细胞
2.1.3 主要试剂、试剂盒及化学药品
2.1.4 试剂的配制
2.1.5 载体
2.1.6 主要仪器设备
2.2 试验方法
2.2.1 TMUV半套式RT-PCR检测方法的建立与应用
2.2.2 TMUV RT-LAMP检测方法的建立与应用
2.2.3 TMUV四种核酸检测方法的比较
2.2.4 不同宿主来源的TMUV的分离与鉴定
2.2.5 TMUV山东分离株SD1001全基因序列测定
2.2.6 靶向干扰TMUV E基因和NS5基因的shRNA序列的筛选
2.2.7 干扰TMUV复制的重组腺病毒的构建与鉴定及体外干扰试验
3 结果
3.1 TMUV半套式RT-PCR检测方法的建立与应用
3.1.1 半套式RT-PCR检测方法的特异性试验结果
3.1.2 半套式RT-PCR检测方法的敏感性
3.1.3 半套式RT-PCR对TMUV临床样品的检测结果
3.2 TMUV RT-LAMP检测方法的建立与应用
3.2.1 TMUV RT-LAMP检测方法的敏感性试验结果
3.2.2 TMUV RT-LAMP检测方法的特异性试验结果
3.2.3 临床样品检测结
3.3 TMUV四种核酸检测方法的比较
3.2.1 四种检测方法的敏感性试验结果
3.2.2 多种检测方法的特异性试验结果
3.2.2 临床样品检测结果
3.4 不同宿主来源的TMUV的分离与鉴定
3.4.1 不同宿主来源的TMUV流行病学调查
3.4.2 麻雀分离株TMUV-SDHS鸭胚培养特性
3.4.3 麻雀分离株TMUV-SDHS细胞培养特性
3.4.4 蚊源分离株TMUV-SDMS细胞培养特性
3.4.5 TMUV-SDHS的E基因和NS5基因的遗传进化分析结果
3.4.6 TMUV-SDHS及TMUV-SDMS株对产蛋鸭致病性研究结果
3.5 TMUV山东分离株SD1001全基因序列测定
3.5.1 TMUV基因组分析结果
3.5.2 TMUV病毒的蛋白的氨基酸比对结果
3.5.3 TMUV 5’末端和3’末端非编码区的分析
3.5.4 TMUV病毒的蛋白的潜在糖基化位点预测
3.5.4 TMUV开放阅读框Bootscan扫描
3.6 靶向干扰TMUV E基因和NS5基因的shRNA序列的筛选
3.6.1 重组载体pEGFP-E及pEGFP-NS5载体的测序鉴定
3.6.2 转染用细胞的选择
3.6.3 荧光标签载体转染293T细胞
3.6.4 shRNA干扰E-GFP和NS5-GFP融合蛋白的表达
3.6.5 shRNA干扰载体与GFP融合蛋白的表达载体共转染后的流式细胞检测
3.6.7 E基因和NS5基因的相对荧光定量检测结果
3.7 干扰TMUV复制的重组腺病毒的构建与鉴定及体外干扰试验
3.7.1 重组腺病毒的包装出毒
3.7.2 重组腺病毒的鉴定
3.7.3 重组腺病毒滴度的测定
3.7.3 重组腺病毒介导的shRNA体外干扰TMUV复制的研究
4 讨论
4.1 TMUV核酸检测方法的建立及四种核酸检测方法的比较
4.1.1 TMUV半套式RT-PCR检测方法的建立与应用
4.1.2 TMUV RT-LAMP检测方法的建立与应用
4.1.3 TMUV四种核酸检测方法的比较
4.2 不同宿主来源的TMUV的分离与鉴定
4.3 TMUV山东分离株SD1001全基因序列测定
4.4 重组腺病毒介导的shRNA干扰TMUV复制的研究
5 结论
参考文献
附录
致谢
博士在读期间发表论文