用于抑制坦布苏病毒感染细胞的多肽及其在制备抑制坦布苏病毒的药物中的应用

摘要

本发明提供用于抑制坦布苏病毒感染细胞的多肽及其在制备抑制坦布苏病毒的药物中的应用，属于分子生物学领域。用于抑制坦布苏病毒感染细胞的多肽，包含鸡热休克蛋白HSPA9羧基端结构域。本发明还提供编码所述多肽的基因、含有所述基因的重组载体、重组菌及其在制备抑制坦布苏病毒感染细胞的多肽中的应用。本发明多肽具有阻止TMUV与靶细胞特异性结合的作用，并呈现抑制TMUV感染细胞的作用，对细胞本身不产生影响和副作用。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于抑制坦布苏病毒感染细胞的多肽及其在制备抑制坦布苏病毒的药物中的应用。

背景技术

坦布苏病毒(Tembusu virus, TMUV)属于黄病毒科黄病毒属中的恩塔亚病毒群。该病毒最早于1955年由PLATTGS等从马来西亚吉隆坡的蚊子中分离到。2000年，在马来西亚霹雳州实兆远区（Sitiawa）的患病肉鸡中分离到TMUV（Sitiawan 株），这是首次确定TMUV对禽类具有致病性。2010年春季，在我国中东部养鸭密集地区的鸭群中爆发了一种以蛋鸭采食量减少、产蛋量急剧下降和肉鸭出现神经症状或死亡为主要特征的传染病，而引发此病的正是TMUV。随后的研究发现，TMUV除了感染鸭外，还可以感染鸡、鹅、鸽子和麻雀，并且在临床上可以导致鸡和鹅的发病。

目前TMUV已成为我国家禽中的一种常在病原，并且频繁引起鸭、鹅甚至鸡的产蛋下降或死亡，给我国的家禽养殖业造成了重大经济损失。虽然已有TMUV灭活疫苗和弱毒疫苗的相关文献报道，但是仍处于实验室研究阶段，其确切的预防效果还需要进一步验证，而抗TMUV卵黄抗体以及现有抗病毒药物的治疗效果并不理想。TMUV作为一种家禽新发传染病的病原，其感染宿主细胞的分子机制仍不清楚，更没有针对TMUV的抗病毒药物可用。因此，十分有必要研制针对TMUV的抗病毒药物。

发明内容

本发明的目的是提供用于抑制坦布苏病毒感染细胞的多肽及其在制备抑制坦布苏病毒的药物中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案来实现。

用于抑制坦布苏病毒感染细胞的多肽，包含鸡热休克蛋白HSPA9羧基端结构域。

优选的技术方案中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供编码所述多肽的基因。

优选的技术方案中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供含有所述基因的重组载体、重组菌。

本发明还提供所述多肽、含有所述基因的重组载体、重组菌在制备抑制坦布苏病毒感染细胞的多肽中的应用。

本发明还提供一种抑制坦布苏病毒的药物组合物，包含所述多肽。

有益效果：

为了实现上述目的，本发明以鸡热休克蛋白HSPA9为设计基础，用体外表达的该蛋白羧基端结构域封闭TMUV表面结构蛋白，阻止TMUV与靶细胞的特异性结合，从而抑制TMUV感染靶细胞。结果表明，SEQ ID No：1所示氨基酸序列的结构域具有阻止TMUV与靶细胞特异性结合的作用，并呈现抑制TMUV感染细胞的作用。本领域技术人员可以根据上述方法设计出包含SEQ ID No：1的多肽或其类似物，用以干扰TMUV与靶细胞的特异性结合。

在本发明中，鸡热休克蛋白HSPA9羧基端结构域通过抑制病毒与靶细胞的特异性结合来抑制TMUV的感染，而对细胞本身不产生影响和副作用，使得该结构域具有很高的特异性和很好的应用前景。

附图说明

图1显示热休克蛋白HSPA9的结构示意图，显示羧基端结构域的位置示意图。

图 2显示了多肽A重组表达产物的电泳图，其中泳道1为未诱导的重组菌，泳道2为诱导表达的重组菌，泳道3为诱导表达的重组菌裂解液沉淀，泳道4为诱导表达的重组菌裂解液上清。

图3是纯化后的多肽A的SDS-PAGE电泳图。

图4显示了体外表达的多肽A对抑制TMUV的感染具有剂量依赖效应。剂量为5μg的多肽A可有效抑制TMUV的感染，抑制效率为44%。但是对照组牛血清白蛋白（BSA）没有此抑制效果。

图5显示多肽A阻止TMUV与靶细胞的特异性结合，从而抑制TMUV感染靶细胞，并且这种抑制作用具有剂量依赖性，但是牛血清白蛋白（BSA）对照组未检测到抑制作用。其中“BSA”为对照组，BSA的剂量为5µg；“多肽A”为多肽A试验组，多肽A的剂量分别为2.5µg和5µg。“Anti-TMUV”为抗TMUV E蛋白单抗的染色观察结果；“Nucleus”为细胞核的DAPI染色观察结果；“Merge”为前两种染色的共聚焦结果。

具体实施方式

实施例1 HSPA9羧基端结构域的获得

如图1所示，鸡热休克蛋白HSPA9第435-675位氨基酸形成了该蛋白的羧基端结构域。该羧基端结构域命名为多肽A，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示,编码基因的序列如SEQ ID No：2所示。人工合成SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，在5’端加上BamH I酶切位点（GAATTC），3’端加上Xho I酶切位点（CTCGAG）。将合成的基因克隆到蛋白表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点BamH I和Xho I位点之间，获得表达多肽A的重组载体。重组多肽A带有GST标签。按照常规方法，将上述重组载体转化BL21(DE3)，获得表达多肽A的重组菌。采用常规方法培养并诱导表达重组菌，从图2可以看出该重组菌实现了可溶性表达多肽A，多肽A的大小为52kD。将诱导表达后的重组菌裂解液上清，通过蛋白表达纯化试剂盒（GST Fusion Protein Purification Kit，购自南京金斯瑞生物科技有限公司）按说明书步骤纯化，得到重组多肽A。重组多肽A的SDS-PAGE电泳检测与预期相一致（图3），能够看到大小为52kD的特异性条带，并且达到了电泳纯。

实施例2 多肽A抑制坦布苏病毒感染细胞

1、按正常细胞培养方法培养DF-1细胞至90%饱和水平。

2、实验分组：多肽A组，将0.5μg、2.5μg和5μg多肽A（实施例1制备）分别与病毒含量为500>50的TMUV在4℃孵育1小时；牛血清白蛋白（BSA）组，将5μg的BSA与病毒含量为500>50的TMUV在4℃孵育1小时；对照组，将DMEM细胞培养液与病毒含量为500>50的TMUV在4℃孵育1小时。

3、将步骤2中各孵育混合物分别接种DF-1细胞，孵育2小时后去掉培养液，用PBS洗涤3次，加入新鲜的DMEM细胞培养液，细胞培养24小时，检测病毒TCID₅₀含量。

实验结果见图4：与对照组相比，BSA组病毒相对含量为104%；加入0.5μg、2.5μg、5μg多肽A的实验组的病毒相对含量分别为91%、70%、56%。通过与对照组对比分析，多肽A组的DF-1细胞中的TMUV含量分别下降9%、30%、44%，这说明使用多肽A能抑制TMUV感染细胞，使细胞得到很好的保护。另外，通过显微镜观察，发现多肽A组中DF-1细胞的形态与对照组中相似，说明多肽A对细胞本身不产生影响，也没有副作用。

实施例3多肽A抑制TMUV感染细胞的机制分析

本实施例为了确定观察到的抑制效应是否与多肽A阻止病毒与细胞的结合有关。多肽A实验组：将多肽A与TMUV在4℃孵育1h，然后与培养至70%饱和水平的DF-1细胞在4℃孵育2h，PBS洗涤后，用4%的多聚甲醛室温固定15min，以TMUV E蛋白单抗（Dongmin Zhao, Xinmei Huang, Yuzhuo Liu, et al. Domain I and II from newly emerging goose tembusu virus envelopeprotein functions as a dominant-negative inhibitor of virus infectivity. Research in Veterinary Science, 2015, 98:121-126）为一抗，以Cy3标记的羊抗鼠IgG为二抗（购自碧云天生物科技有限公司），进行免疫荧光检测。对照组：以BSA替代多肽A与TMUV孵育。

实验结果：如图5所示，多肽A可封闭TMUV表面的结构蛋白，阻止TMUV吸附靶细胞，从而抑制TMUV感染靶细胞。并且多肽A的这种干扰TMUV与DF-1细胞结合的作用具有一定的剂量依赖性。而BSA却不能抑制TMUV与DF1细胞的结合。

SEQUENCE LISTING

<110>江苏省农业科学院

<120>用于抑制坦布苏病毒感染细胞的多肽及其在制备抑制坦布苏病毒的药物中的

应用

<130>20160630

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>241

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>多肽A

<400>1

Thr Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu

1 5 1015

Thr Leu Gly Gly Val Phe Thr Lys Leu Ile Asn Arg Asn Thr Thr Ile

202530

Pro Thr Lys Lys Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Ala Asp Gly Gln Thr

354045

Gln Val Glu Ile Lys Val Cys Gln Gly Glu Arg Glu Met Ala Ser Asp

505560

Asn Lys Leu Leu Gly Gln Phe Thr Leu Val Gly Ile Pro Pro Ala Pro

65707580

Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly

859095

Ile Val His Val Ser Ala Lys Asp Lys Gly Thr Gly Arg Glu Gln Gln

100 105 110

Ile Val Ile Gln Ser Ser Gly Gly Leu Ser Lys Asp Glu Ile Glu Asn

115 120 125

Met Val Lys Asn Ala Glu Lys Tyr Ala Glu Glu Asp Arg Arg Arg Lys

130 135 140

Glu Arg Val Glu Ala Val Asn Leu Ala Glu Gly Ile Ile His Asp Thr

145 150 155 160

Glu Ser Lys Met Glu Glu Phe Lys Asp Gln Leu Pro Ala Asp Glu Cys

165 170 175

Asn Lys Leu Lys Glu Glu Ile Ala Lys Met Arg Glu Leu Leu Ala Arg

180 185 190

Lys Asp Thr Glu Thr Gly Glu Asn Ile Arg Gln Ala Ala Thr Ser Leu

195 200 205

Gln Gln Ala Ser Leu Lys Leu Phe Glu Met Ala Tyr Lys Lys Met Ala

210 215 220

Ser Glu Arg Glu Ser Ser Gly Ser Ser Gly Asp Gln Lys Glu Glu Lys

225 230 235 240

Gln

<210>2

<211>723

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>多肽A的编码基因

<400>2

actgatgtgc tgctgctgga tgtgactccc ctctccttgg ggattgagac attaggcggt 60

gtcttcacaa agctcatcaa caggaatact accataccaa ccaagaagag ccaggtgttt120

tctactgctg cggatgggca gacacaagtg gagattaaag tatgccaggg ggagagagag180

atggccagtg acaacaaact tcttggccag ttcaccttgg ttgggattcc tccagcacca240

cgtggggtgc cccagattga ggtcactttt gacattgatg ctaatggtat cgttcatgtg300

tcagccaagg acaaaggcac tggacgtgaa cagcaaattg ttatccagtc ttctggtggc360

cttagcaaag atgaaattga gaacatggtg aagaacgcag agaaatatgc agaggaagac420

agacgaagaa aggaacgtgt ggaagctgta aacctggctg aaggcatcat ccatgataca480

gagtctaaga tggaggaatt caaggatcag ctgccagcag atgagtgcaa caaattgaag540

gaagaaattg ccaaaatgag agaacttctg gctcgtaaag acactgaaac gggagaaaat600

attaggcagg cagcaaccag tctgcagcag gcttccttga aactctttga aatggcatac660

aagaagatgg cctccgaacg agagagttct ggaagttcag gagatcagaa ggaagagaag720

caa723