不同极限pH值牛肉成熟过程中品质变化及变化机制研究

摘要

在有关牛肉的众多食用品质中，嫩度及一致性是衡量品质优劣的一个重要指标，直接影响到消费者的选择。尽管对肉品领域已经进行了数多年的相关研究，也取得了许多一致和存在分歧的成果，但准确预测牛肉的嫩度依然是牛肉生产企业的一项重要任务。
　　对于预测牛肉嫩度所面临的困难，主要是由于支撑肌肉嫩度基础的生物复杂性，不仅体现在遗传组、转录组和蛋白质组水平，也与外在因素如生殖繁育条件（养育条件、饲喂、体力活动和宰前应激等）和宰后处理（温度、pH、贮藏条件、吊挂方式、延迟冷却和电刺激等）有重要联系。其中宰后极限pH值(pHu)对于牛肉品质的形成具有重要意义。目前对于pHu能够对宰后肌肉的色泽和保水性方面产生影响，已基本达成共识，但是对于机理的研究仍在继续探讨中;而关于pHu对于宰后肌肉嫩度的影响，特别是成熟期间不同pHu牛肉嫩化速率是否一致鲜有报道。肌肉成熟过程蛋白质的变化与肌肉品质存在很强相关性，对于肌肉嫩度的变化具有重要意义。本研究通过研究不同pHu牛肉成熟过程的品质变化规律，探讨各指标与pHu的关系，特别是嫩度与pHu的关系，揭示宰后影响牛肉嫩度的生化基础是否与pHu有关;同时借助蛋白质组iTRAQ技术对不同pHu牛肉的蛋白质表达进行研究，以便更深入了解不同pHu牛肉品质形成的分子机制，为进一步研究肉质差异提供相关科学依据。主要研究结果如下:
　　1、我国牛肉pHu的分布规律
　　通过对我国几个肉牛屠宰企业近3000头肉牛进行调研，测定宰后24 h胴体背最长肌pHu，发现pHu分布范围比较广泛，pHu≤5.80的胴体占总数的62％;5.80＜pHu≤6.10的胴体占总数的21％; pHu＞6.10的胴体占总数的17％。一般认为正常牛肉的pHu≤5.80，由此看来我国目前的生产条件下所生产的牛肉仍有近38％的牛肉处于非正常pHu范围。
　　2、不同pHu牛肉成熟过程中品质的变化
　　根据pHu将牛肉分为三个组别:低pHu(pHu≤5.80)组，中pHu(5.80＜pHu≤6.10)组和高pHu(pHu＞6.10)组，4℃条件进行为期9天的成熟。不同pHu牛肉成熟期间色泽、汁液损失、蒸煮损失、嫩度及嫩化速率和MFI值变化存在显著差异(P＜0.05)，其中L*、汁液损失、蒸煮损失与pHu显著负相关(P＜0.01); MFI与pHu显著正相关(P＜0.01)。高pHu组样品始终具有最低的剪切力值(P＜0.05)，随着成熟时间的延长，所有牛肉的剪切力值都能显著降低(P＜0.05)，中和低pHu组样品最初3天剪切力值差异不显著(P＞0.05)，从第5天开始中pHu组样品剪切力值显著高于低pHu组(P＜0.05)，说明中pHu样品嫩化速率最慢，如果要想达到一致的嫩度要求，中pHu组样品需要更长的成熟时间。
　　3、不同pHu牛肉成熟过程中肌肉蛋白质降解的变化
　　通过对成熟过程中不同pHu牛肉肌原纤维蛋白进行SDS-PAGE分析，发现pHu对维持肌肉组织结构稳定的主要肌原纤维蛋白α-actin，desmin，actin，troponin-T，myosinlight chainl，troponin-I，troponin-C，myosin light chain2的降解速率存在显著影响(P＜0.05)。高pHu牛肉肌原纤维蛋白降解最为迅速，在宰后1d即出现大量降解条带;低pHu组宰后3d内降解较为缓慢，而后期也出现大量降解;中pHu牛肉整个成熟过程蛋白的降解最为缓慢，且降解条带最为微弱。伴随着这些完整肌肉组织蛋白的降解，同时出现了分子量大约为175-138 kDa，92-68 kDa，49-46 kDa，32-27 kDa的降解产物，并且这些产物的增加趋势与完整组织蛋白降解趋势相对应。
　　采用免疫印迹技术(Western blot)对主要的肌原纤维骨架蛋白desmin和troponin-T降解进行分析，发现这两种蛋白的降解趋势与SDS-PAGE结果一致。高pHu组牛肉，从宰后0.5 h到宰后3d，完整desmin蛋白(54 kDa)发生降解，伴随产生较大浓度的小分子量降解条带(50 kDa-39 kDa)。从宰后5d开始，desmin(54 kDa)以及50 kDa和47 kDa的降解产物条带开始明显减少，同时生成浓度高的39 kDa和34 kDa降解条带;低pHu牛肉desmin蛋白降解速率明显缓于高pHu组牛肉，宰后3d才有39 kDa的降解条带产生，而整个成熟期间未见34 kDa降解条带生成;中pHu牛肉的desmin蛋白降解模式明显低于高pHu和低pHu组牛肉，在整个成熟期间desmin蛋白(54 kDa)始终保持较好的完整性，仅有微弱的降解条带可见。对于troponin-T蛋白，在高pHu组和低pHu组牛肉，从宰后0.5 h开始，完整的troponin-T蛋白条带便开始降解，38 kDa和36 kDa降解条带的浓度随着时间的延长逐渐增强。并且高pHu组牛肉从宰后0.5 h开始有30 kDa和28 kDa降解条带，宰后3d出现34 kDa和32 kDa降解条带;中pHu牛肉，在整个成熟期间，troponin-T蛋白始终保持较高的完整性和很高的浓度，仅在宰后3d才有微弱的降解条带出现。
　　4、不同pHu牛肉成熟过程中μ-calpain的变化
　　采用Western blot对肌肉成熟过程中起到关键作用的钙激活酶(μ-calpain)进行分析，发现高pHu牛肉中的μ-calpain在宰后30 min就开始出现明显的自溶现象，表明μ-calpain对肌肉蛋白的水解作用在宰后很短时间即开始启动，随着成熟时间的延长，μ-calpain分子中具有水解活性的的80 kDa和78 kDa亚基条带逐步减弱，直至宰后9d时80 kDa条带完全降解为没有活性的76 kDa亚基;在低pHu牛肉中μ-calpain在宰后1d时80 kDa亚基条带才开始出现明显的自溶现象，一直到宰后9d该条带才基本消失，同时78 kDa条带从宰后5d开始减弱;而中pHu牛肉中μ-calpain自溶速率更为缓慢，宰后9d时80 kDa条带仍然可见，而且整个成熟期间78 kDa条带未见明显的降解。
　　5、不同pHu牛肉中差异表达蛋白研究
　　采用iTRAQ技术，对宰后24 h的高、中、低pHu牛肉的蛋白质表达进行研究，一共鉴定出具有意义的蛋白927个，其中差异倍数在1.5倍以上的差异表达蛋白有61个，这些差异蛋白主要涉及能量代谢、蛋白水解、细胞凋亡、防御及应激和组织结构等方面，其中糖酵解酶类，如creatine kinase M chain、glycerol-3-phosphate dehydrogenase、L-lactatedehydrogenase A chain、 triosephosphate isomerase、 phosphoglycerate kinase、phosphoglucomutase-1 isoform X1等;组织结构蛋白，如tubulin、troponin-C、troponin-I、tropomyosin alpha-1 chain、tropomyosin beta chain isoform和four and a half LIM domainsprotein1 isoform1(FHL1);细胞凋亡蛋白voltage-dependent anion-selective channel protein1 isoform X4和应激蛋白heat shock protein beta-1 isoform X1(HSPB1\HSP27)peroxiredoxin-6等。这些由于pHu引起的差异蛋白主要通过糖酵解途径、钙激活酶与细胞凋亡酶途径、防御与应激途径参与宰后肌肉组织的变化，从而对牛肉的品质及嫩度变化产生影响。
　　pHu能够通过影响肌肉的蛋白质降解速率、钙激活酶活性以及蛋白质组的差异表达来影响宰后牛肉的嫩度及嫩化速率，高pHu牛肉嫩化速率最快，低pHu牛肉次之，中pHu牛肉最慢，因此研究不同pHu牛肉品质变化对进一步了解导致牛肉嫩度差异的生化基础具有一定的意义。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 我国肉牛产业发展概况

1．2 宰后肌肉的变化

1．2．1 宰后肌肉组织结构的变化

1．2．2 宰后肌肉代谢变化

1．3 影响宰后肌肉嫩度的因素

1．3．1 品种和性别

1．3．2 年龄

1．3．3 营养及育肥方式

1．3．4 肌节长度

1．3．5 结缔组织和肌内脂肪

1．3．6 细胞骨架蛋白

1．3．7 肌肉蛋白水解酶

1．4 极限pH值与肌肉品质的关系

1．4．1 极限pH值的形成及影响因素

1．4．2 极限pH值与保水性的关系

1．4．3 极限pH值与肉色的关系

1．4．4 极限pH值与嫩度的关系

1．5 蛋白质组学在肉品学研究中的应用

1．5．1 蛋白质组学技术概况

1．5．2 蛋白质组学技术在宰后肌肉研究中的应用

1．6 研究目的和意义

1．7 主要研究内容

2 材料与方法

2．1 试验仪器与试剂

2．1．1 仪器

2．1．2 试剂

2．2 试验设计

2．2．1 pHu分布规律的调查

2．2．2 不同pHu牛肉范围划分方法

2．3 试验方法

2．3．1 pH值测定

2．3．2 贮藏汁液损失率测定

2．3．3 肉色测定

2．3．4 蒸煮损失率测定

2．3．5 剪切力值测定

2．3．6 肌节长度测定

2．3．7 肌纤维小片化指数测定

2．3．8 肌肉蛋白SDS-PAGE电泳

2．3．9 免疫印迹分析

2．3．10 基于iTRAQ技术对不同pHu牛肉进行蛋白质组分析

2．3．11 生物信息学分析

2．4 数据统计分析

3 结果与分析

3．1 不同极限pH值牛肉分布规律

3．2 不同pHu牛肉成熟过程中品质的变化

3．2．1 不同pHu牛肉成熟过程中剪切力值的变化

3．2．2 不同pHu牛肉成熟过程中肌纤维小片化指数的变化

3．2．3 不同pHu牛肉成熟过程中肌节长度的变化

3．2．4 不同pHu牛肉成熟过程中嫩化速率的变化

3．2．5 不同pHu牛肉成熟过程中保水性的变化

3．2．6 不同pHu牛肉成熟过程中表面颜色的变化

3．2．7 成熟期间牛肉各个品质指标的相关性分析

3．3 肌原纤维蛋白的SDS-PAGE图谱分析

3．4 不同pHu牛肉成熟过程中desmin降解变化

3．5 不同pHu牛肉成熟过程中troponin-T降解变化

3．6 不同pHu牛肉成熟过程中μ-calpain降解变化

3．7 对不同pHu牛肉差异表达蛋白的研究

3．7．1 差异表达蛋白的确定

3．7．2 差异表达蛋白GO富集分析

3．7．3 差异表达蛋白KEGG pathway分析及生物信息学分析

4 讨论

4．1 影响中国肉牛pHu的原因

4．2 pHu对成熟过程中牛肉品质的影响

4．3 pHu对成熟过程牛肉嫩化速率的影响

4．4 不同pHu牛肉差异表达蛋白的功能及对嫩度的影响途径

4．4．1 糖酵解途径

4．4．2 钙激活酶及细胞凋亡途径

4．4．3 防御与应激途径

5 结论

6 创新点

7 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文情况