一株鸭源植物乳杆菌的分离鉴定及其对肉鸭生产性能和免疫机能的影响

摘要

随着畜牧业的发展，养殖业中抗生素的滥用导致的细菌耐药性增加，养殖成本增高及药物残留等问题愈来愈严重引起了普遍注意，多个国家的对抗生素的种类、使用剂量、使用方法、剂量等进行限制，因此一种新的可替代抗生素、抗菌药物且无毒无副作用无残留的新型制剂——微生态制剂在生产中应用越来越普遍。而微生态制剂因为改善体内环境，减少药物残留，调节胃肠道平衡，增强免疫能力减少疾病发生等多方面优势成为部分抗生素新的替代品，并被许多国家用于继维生素、微量元素、氨基酸之后的第四类常用饲料添加剂。在微生态制剂中，乳酸菌活性制剂应用最为广泛。本文旨在研究从健康鸭子肠道内分离出的一株植物乳杆菌体外抑菌试验及该乳酸菌在肉鸭的生长，调节肠道菌群，免疫力等方面的影响。本试验分为两部分。
　　试验一:鸭源植物乳杆菌的分离鉴定及其体外抑菌试验
　　用MRS培养基从20日龄健康鸭子盲肠内容物分离筛选出两株能够产生明显溶钙环的乳酸菌菌株，并进行分子学鉴定，结果两株分别是植物乳杆菌和乳酸乳球菌。然后通过细菌平板计数法证明植物乳杆菌对奇异变形杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、宋内志贺氏菌、金黄葡萄球菌、沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、鸭疫里默氏杆菌等致病菌均有不同程度的抑制作用，其中代谢产物为添加量的4％时抑菌率分别为33.00％、28.47％、29.27％、37.84％、22.30％、79.52％、20.62％和20.00％，添加量为10％时抑菌率分别为78.60％、54.14％、68.97％、77.78％、84.21％、96.77％、77.64％和66.00％，其中对沙门氏菌的抑制最为明显作用最强，添加量到10％时均达到50％以上。
　　试验二:鸭源植物乳酸菌对肉鸭生产性能、免疫等方面的影响
　　用分离的鸭源植物乳杆菌经发酵后制成活菌数为5.475×109 CFU/mL的乳酸菌液。将120只1日龄健康樱桃谷雏鸭随机分成两组，每组60只。一组为对照组，二组为试验组，二组在饮水中添加1％的植物乳杆菌发酵液，采用自由采食和自由饮水方式，其他管理方式均相同。试验结果:试验组周增重比对照组大，且14-28日龄差异越来越大，一直到35日龄，试验组显著高于对照组(p＜0.05)。肉料比上14日龄之前对照组肉料比高于试验组，至21日龄开始试验组高于对照组，到35日龄相差显著(p＜0.05)。在免疫器官指数上，试验组的胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数均大于对照组，28日龄时试验组与对照组的胸腺指数和法氏囊指数差异最大(p＜0.05)，试验组分别高出33.80％和18.67％，21日龄试验组脾脏指数差异最大(p＜0.05)，比对照组高18.93％。在对肠道结构的影响上，试验组回肠和盲肠的肠壁厚度及绒毛长度均高于对照组，在35日龄差异显著(p＜0.05)。在肠道菌群的调节上，试验组中的盲肠内容物的大肠杆菌数量比对照组的少，而乳酸菌数比对照组多，尤其在20日龄以后比较明显。
　　试验证明乳酸菌的代谢产物能够抑制有害致病菌的生长且乳酸菌能够调节肉鸭肠道菌群平衡，改变肠道结构，促进肉鸭生长发育，提高肉料比及促进免疫器官的生长发育，增强肉鸭的免疫能力。试验结果为乳酸菌在鸭病的防治应用和微生态制剂中的开发应用或者现有复方的调整提供理论依据。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 微生态制剂的概念

1．2 微生态制剂分类

1．2．1 酵母菌

1．2．2 芽孢杆菌

1．2．3 双歧杆菌

1．2．4 乳酸菌

1．3 机体内肠道的菌落

1．3．1 机体内菌落相互作用

1．3．2 机体内正常菌群的生理作用

1．4 乳酸菌的研究进展

1．4．1 乳酸菌的作用机理

1．4．2 乳酸菌的作用途径

1．4．3 乳酸菌作用

1．5 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 培养基

2．1．3 分子生物学试剂

2．1．4 电泳缓冲液的配制

2．1．5 琼脂糖凝胶的配制

2．1．6 主要仪器和设备

2．1．7 指示菌株

2．2 鸭源乳酸菌的分离

2．3 鸭源乳酸菌的鉴定

2．3．1 16S rDNA的鉴定

2．3．2 阳性克隆序列测定

2．4 乳酸菌的体外抑菌试验

2．4．1 菌体、代谢产物、菌液的抑菌活性鉴定

2．4．2 代谢产物的制备

2．4．3 体外抑菌试验

2．5 乳酸菌对肉鸭生产性能及体液免疫的影响

2．5．1 饲喂制剂

2．5．2 试验日粮

2．5．3 试验动物分组

2．5．4 称重

2．5．5 免疫

2．5．6 免疫器官指数的测定

2．5．7 NDV抗体效价的测定

2．5．8 盲肠内容物中乳酸杆菌、大肠杆菌、双歧杆菌的数量变化

2．5．9 肠道切片HE染色

2．5．10 统计与分析

3 结果与分析

3．1 两株乳酸菌的菌落形态

3．2 两株乳酸菌的革兰氏染色结果

3．3 两株乳酸菌目的基因的检测和测序结果

3．3．1 PCR扩增目的基因的电泳结果

3．3．2 酶切鉴定结果

3．3．3 测序结果及植物乳杆菌的进化关系图

3．4 植物乳杆菌菌体、代谢产物、菌液抑菌活性的比较

3．5 体外抑菌结果

3．6 植物乳杆菌发酵液对樱桃谷鸭生产性能的影响

3．7 植物乳杆菌发酵液对樱桃谷鸭免疫器官的影响

3．8 植物乳杆菌发酵液对樱桃谷鸭肠道结构的影响

3．9 植物乳杆菌发酵液对樱桃谷鸭肠道菌群的影响

4 讨论与分析

4．1 菌种筛选的主要依据

4．2 抑菌作用的研究

4．3 对肉鸭生产性能的影响

4．4 对免疫器官的影响

4．5 对肠道微生物的影响

4．6 对肠道结构的影响

5 结论

参考文献

致谢

附图