小麦芽内源性阿拉伯木聚糖降解酶的初步研究

摘要

如今小麦及小麦芽已广泛应用于啤酒酿造。阿拉伯木聚糖(AXs)是构成小麦细胞壁的主要非淀粉多糖，其合理降解会对麦汁及啤酒粘度、浊度、过滤速度，终啤酒的泡沫性能、醇厚性等产生重要影响。AXs结构复杂，其降解需要一个完善的降解酶系。小麦芽中存在的内源性AXs降解酶主要包括内切-β-1，4-D-木聚糖酶（EC3.2.1.8，简称木聚糖内切酶）、β-D-木糖苷酶(EC3.2.1.37)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（EC3.2.1.55，简称阿拉伯糖苷酶）等。本文通过对烟农24小麦芽中木聚糖内切酶进行分离纯化，得到了电泳条带单一的木聚糖内切酶，并研究了其酶学性质;研究了小麦芽β-D-木糖苷酶粗酶的酶学性质;探究了制麦过程中木聚糖内切酶、β-D-木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶的酶活变化及WEAXs含量和分子量的变化规律，主要研究结果如下:
　　(1)小麦芽木聚糖内切酶的分离纯化:经过40％-60％硫酸铵沉淀、Q-Sepharose FastFlow阴离子交换层析和Phenyl-Sepharose6 F F疏水柱层析，得到电泳条带单一的木聚糖内切酶。纯化倍数为11.72倍，比活力为4.30u/mg，纯化后的木聚糖内切酶分子量为27.8kDa;其最适反应pH值6.0;最适反应温度40℃; Na+对其活性基本没有影响，Ca+、Mg2+、K+对其酶活有强烈的激活作用，Cu2+对其活性有强烈的抑制作用。
　　(2)小麦芽β-D-木糖苷酶的最适pH为4.5和3.5，可能存在同工酶;pH在3.0-6.0范围内酶活相对稳定，pH7.0时相对酶活仅为26.2％。最适反应温度为70℃;在35-60℃范围内，该酶的温度稳定性较好;在70-80℃时，温度稳定性较低，在80℃处理20min后，该酶失去活性。Cu2+对β-D-木糖苷酶活性有明显的抑制作用。小麦β-D-木糖苷酶对对-硝基苯-β-D-木糖苷的米氏常数Km为1.74mmol·L-1，最大反应速度Vmax为0.76mM·min-1。
　　(3)浸麦结束木聚糖内切酶酶活力明显增加，增幅为507.09％;发芽开始后该酶活性出现略微下降，随后酶活逐渐上升，到第4天达到最大值10.10u，发芽4-5天时该酶活性趋于稳定;干燥过程中该酶的失活率为65.82％。从制麦开始到发芽第5天，阿拉伯糖苷酶的酶活性逐渐上升，到第5天时达到最大值40.07u，发芽4-5天时该酶活性趋于稳定;干燥过程中该酶的失活率为69.58％。从制麦开始到发芽第5天，β-D-木糖苷酶的酶活性一直增加，到发芽第5天酶活仍有上升的趋势，发芽第5天时酶活达到最大值170.31u;干燥过程中该酶活性有所下降，失活率为18.74％。与前两种酶相比，在干燥过程中，β-D-木糖苷酶的失活率较小。
　　(4)制麦后小麦芽WEAXs净增0.75％，比原麦提高了163.04％。WEAXs含量的增加主要出现在浸麦过程和发芽第1天，尤其是发芽第1天，其含量增加了0.46％比原麦提高了100％。分子量为0.4-6.2kDa的组分是WEAXs的主要组分，原麦WEAXs中该组分比例为56.8％，制麦后比例上升到75.85％，增加了18.87％。从制麦开始到发芽第1天，大于35.4kDa的大分子量组分含量逐渐增加;发芽第2-5天，大分子量组分含量逐渐降低。而在制麦过程中，0.4-35.4kDa的小分子量组分含量不断增加，制麦后增加了218.81％。由此推测大于35.4kDa的大分子量组分含量可能会降解生成小分子量组分，造成大分子量组分含量降低。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 小麦及小麦芽

1．1．1 小麦芽的酿造学特性

1．2 AXs

1．2．1 AXs的结构

1．2．2 AXs的分类

1．2．3 AXs的含量及分布

1．2．4 AXs的理化性质

1．2．5 AXs的功能性质

1．3 AXs对制麦、酿造和成品啤酒的影响

1．3．1 啤酒原料中的AXs

1．3．2 糖化麦汁中的AXs

1．3．3 啤酒中的AXs

1．4 AXs降解酶

1．4．1 AXs降解酶概况

1．4．2 小麦AXs降解酶的研究

1．4．3 大麦AXs降解酶的研究

1．4．4 制麦过程中AXs降解酶的研究

1．5 木聚糖内切酶

1．5．1 来源及分类

1．5．2 酶学性质

1．5．3 分离纯化

1．5．4 研究进展

1．6 β-D-木糖苷酶

1．6．1 来源及分类

1．6．2 酶学性质

1．7 立题背景及研究目的意义

1．8 主要研究内容及目标

1．8．1 研究内容

1．8．2 研究目标

1．8．3 研究路线

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 实验方法

2．4．1 小麦芽制备方法

2．4．2 蛋白质含量的测定

2．4．3 木聚糖内切酶的分离纯化

2．4．4 木聚糖内切酶酶学性质的研究

2．4．5 β-D-木糖苷酶酶学性质的研究

2．4．6 阿拉伯糖苷酶酶活的测定

2．4．7 WEAXs含量的测定

2．4，8 WEAXs分子量的测定

2．4．9 数据分析方法

3 结果与分析

3．1 木聚糖内切酶的分离纯化

3．1．1 木聚糖内切酶的硫酸铵分级沉淀

3．1．2 Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析

3．1．3 Phenyl-Sepharose 6 F F疏水柱层析

3．1．4 木聚糖内切酶的纯度鉴定

3．1．5 纯化方案的评价

3．2 木聚糖内切酶酶学性质的初步研究

3．2．1 木聚糖内切酶的最适pH值

3．2．2 木聚糖内切酶的最适温度

3．2．3 金属离子对木聚糖内切酶的影响

3．3 β-D-木糖苷酶粗酶液的性质

3．3．1 β-D-木糖苷酶反应时间的确定

3．3．2 pH值对β-D-木糖苷酶活性的影响

3．3．3 温度对β-D-木糖苷酶活性的影响

3．3．4 金属离子对β-D-木糖苷酶活性的影响

3．3．5 β-D-木糖苷酶反应动力学参数测定

3．4 制麦过程中小麦芽品质分析

3．5 制麦过程中小麦芽AXs降解酶活力的变化

3．5．1 木聚糖内切酶酶活力变化

3．5．2 阿拉伯糖苷酶酶活力变化

3．5．3 β-D-木糖苷酶酶活力变化

3．6 制麦过程中WEAXs含量及分子量的变化

3．7 小麦芽指标及WEAXs含量的相关性分析

3．8 AXs降解酶与小麦芽指标及WEAXs含量的相关性分析

4 讨论

4．1 木聚糖内切酶的分离纯化

4．2 β-D-木糖苷酶酶学性质

4．3 制麦过程中AXs降解酶的研究

4．4 进一步研究方向

5 结论

参考文献

致谢

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